時效調控HGF修飾的幹細胞治療股骨頭壞死的實驗研究

《時效調控HGF修飾的幹細胞治療股骨頭壞死的實驗研究》是依託南昌大學，由程細高擔任項目負責人的地區科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：時效調控HGF修飾的幹細胞治療股骨頭壞死的實驗研究
• 項目類別：地區科學基金項目
• 項目負責人：程細高
• 依託單位：南昌大學

項目摘要

股骨頭壞死（ONFH）是嚴重的致殘性疾病。研究表明，骨髓基質幹細胞（BMSCs）移植對ONFH具有一定的修復作用，但存在壞死區血供差不利於BMSCs存活等問題。因而如何改善缺血壞死區微環境以提高BMSCs對ONFH的修復作用是該研究領域亟待解決的問題。有研究顯示肝細胞生長因子（HGF）可在缺氧的條件下有效阻止BMSCs調亡、促血管生成及誘導其定向分化，且已證實HGF修飾的BMSCs對心肌缺血有良好的修復作用，但HGF過量表達又存在誘發肉瘤等風險。為有效改善缺血壞死區微環境以促進BMSCs對ONFH的修復，降低風險，本項目擬構建表達HGF的四環素調控重組腺病毒AdTRE-HGF,對BMSCs進行基因修飾，以達到可通過外源性給藥有效調控HGF的釋放之目的，並進行體內移植實驗觀察比較其對ONFH的修復效果，為套用BMSCs治療ONFH建立新途徑，提供新思路。

結題摘要

本研究包括四部分內容，即：（1）攜帶Tet-on系統和HGF基因的重組桿狀病毒的構建；（2）兔BMSCs的原代培養、擴增、鑑定及兔ONFH模型的構建；（3）重組桿狀病毒轉染兔BMSCs並通過Dox調控目的基因的表達；（4）在Dox調控下攜帶HGF基因的兔BMSCs對壞死股骨頭的修復作用。在第一部分中，以F: 5’-AGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’ ；R: 5’-GTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCC-3’為eGFP合成模板；以F: 5’-AGGATCCATGTGGGTGACCAAACTCC-3’ ；R: 5’-GTCTAGACTATGACTGTGGTACCTTATA-3’為HGF合成模板；以pTet-on Advanced為四環素調控系統，成功構建重組桿狀病毒Ac-eGFP和Ac-HGF。在第二部分中，通過密度梯度離心法成功分離培養出原代兔BMSCs，通過換液、傳代行細胞純化，倒置相差顯微鏡下示細胞貼壁生長、形態呈均質梭形，流式細胞儀檢測細胞表面分子標記物示CD29（+）、CD34（-），表明所得細胞為骨髓間充質幹細胞。在非脫位下以液氮槍冷凍法成功構建兔股骨頭缺血性壞死（ONFH）模型，通過大體標本觀察、MRI、組織學檢查等表明造模法壞死率高、死亡率低，適於後續研究。在第三部分中，以Ac-eGFP轉染兔BMSCs，成功實現在Dox調控下eGFP表達量的相應變化，表明搭載Tet-on系統的重組桿狀病毒可成功轉染兔BMSCs。當以Ac-HGF轉染兔BMSCs， Dox誘導濃度為1000ng/ml時，ELISA檢測兔BMSCs中HGF表達量達最大值，且目的基因的表達在轉染第3天達峰值。在第四部分中，往造好模的兔股骨頭、頸區注入攜帶HGF的BMSCs液體並口服Dox，常規籠養1月後，行股骨頭大體觀察、影像學檢查及組織學檢查等均表明通過可調控HGF表達的BMSCs移植修復壞死股骨頭效果明顯好於其他處理組。綜上，本研究通過將攜帶Tet-on系統的重組桿狀病毒Ac-HGF轉染兔BMSCs成功獲得可通過Dox時效調控HGF表達的BMSCs，將其移植至兔ONFH模型行壞死股骨頭的修復取得理想的效果。