旋毛蟲抗腫瘤蛋白基因及其功能研究

《旋毛蟲抗腫瘤蛋白基因及其功能研究》是依託吉林大學，由王學林擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：旋毛蟲抗腫瘤蛋白基因及其功能研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：王學林
• 依託單位：吉林大學

項目摘要

旋毛蟲包囊形成過程中寄生基因產生的寄生蛋白通過模擬宿主肌細胞凋亡調控下的細胞修復機制形成nurse cell，這種調控機制同腫瘤細胞的凋亡信號調控機制極其相似。我們的研究證實旋毛蟲蟲體蛋白中存在調控腫瘤細胞凋亡的活性蛋白，且該蛋白通過線粒體和死亡受體凋亡途徑參與調控人白血病細胞系K562、人肝癌細胞系H7402的凋亡。為獲得該蛋白的全基因序列，本研究利用已建立的旋毛蟲成蟲和新生幼蟲的T7噬菌體展示文庫，採用Giordan的有機相多細胞淘選法篩選與K562、H7402特異結合的目的蛋白，利用旋毛蟲cDNA文庫為模板釣取其全長序列，通過構建原核表達載體表達目的蛋白，採用Ni-NTA His. Bind離子交換樹脂純化融合蛋白，復性後檢測其誘導腫瘤細胞凋亡及抗腫瘤功能，為研發可恢復腫瘤細胞的凋亡程式，增加腫瘤細胞對化療及放療的敏感性，並具有自主智慧財產權的抗腫瘤藥物奠定基礎。

結題摘要

本研究成功構建了旋毛蟲T7噬菌體cDNA展示文庫，利用該文庫採用有機相多細胞親和淘選法篩選出和人白血病細胞系K562、人肝癌細胞系H7402特異結合的候選蛋白A200711（該蛋白分子量為16736.3，分子式為C765H1163N205O205S7，疏水性指數是84.04），在後續研究中以旋毛蟲cDNA文庫為模版，針對旋毛蟲A200711基因序列設計特異性引物，通過PCR擴增目的片段並克隆至表達載體pET28a，將成功構建的重組表達質粒pET28a-A200711轉化至大腸桿菌BL21（DE3）中，IPTG誘導表達，經Ni親和層析柱純化並柱上復性後得到重組蛋白，SDS-PAGE、 Western blotting檢測表明旋毛蟲A200711蛋白在重組菌中成功得到表達。純化、復性後的不同濃度旋毛蟲A200711蛋白能有效抑制人肝癌細胞系H7402的增殖，並存在“量效-時效”關係，對人正常肝細胞系H7702的增殖不存在具有統計學意義的影響。Annexin V-FITC法檢結果顯示增加蛋白劑量會增強其促凋亡的作用，且具有線性關係。細胞周期檢測發現旋毛蟲A200711蛋白作用H7402肝癌細胞後會使細胞周期發生改變，細胞周期被阻滯於S期，蛋白濃度較高時出現明顯的sub-G1凋亡峰。建立了人肝癌細胞系H7402裸鼠皮下種植瘤模型，實體瘤研究表明旋毛蟲A200711蛋白可以抑制肝癌細胞系H7402裸鼠皮下種植瘤的生長，和陽性對照抗腫瘤常用藥物順鉑（DDP）相比，蛋白作用組對裸鼠的生理狀況影響較小。本研究表明旋毛蟲A200711蛋白在體內、體外均可抑制H7402細胞的增殖，誘導腫瘤細胞的凋亡，且對人正常肝細胞系H7702的生長無影響；與抗腫瘤常用藥物順鉑相比，旋毛蟲A200711蛋白具有副作用小、藥效溫和的特點，這為旋毛蟲A200711蛋白成為抗腫瘤候選藥物提供了一定的研究基礎。本研究共發表SCI 論文6篇，核心論文2篇，英文國際會議論文（10篇），共培養博士研究生2名（已畢業），碩士研究生5名（其中3名已畢業）。待發表SCI 論文1篇。