《新活化分子ZCH-2B8a抗原的鑑定及在T細胞免疫應答中的功能》是依託浙江大學，由徐曉軍擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：新活化分子ZCH-2B8a抗原的鑑定及在T細胞免疫應答中的功能
- 依託單位：浙江大學
- 項目負責人：徐曉軍
- 項目類別：青年科學基金項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
活化分子在T細胞免疫應答及調控中起重要作用，有很好的臨床套用前景，現未見有活化分子介導T細胞攝取胞外蛋白的報導。ZCH-2B8a是本研究組在研製抗白血病幹細胞單抗過程中製備所得，經HLDA-8鑑定性質未明。前期研究表明其識別的抗原是一早期、穩定的T細胞活化分子，具有介導抗體在不同溫度下快速內化的能力。我們推測該抗原可能介導T細胞攝取胞外蛋白。為明確該抗原的屬性及功能，本課題擬採用噬菌體展示技術克隆出2B8a抗原的基因序列，Edman降解法測定其胺基酸序列；通過對F-actin、dynamin及clathrin內化途徑的抑制研究其介導內化的機制；並採用RNA干擾技術抑制T細胞2B8a抗原表達，觀察抑制前後T細胞活化及攝取功能的變化。本課題將明確2B8a抗原序列，初步闡明其在T細胞免疫應答中的功能，為研究T細胞攝取行為與免疫應答及調控中的作用奠定基礎，並可能發現新的CD分子和新的蛋白內化機制。
結題摘要
ZCH-2B8是本研究組在研製抗白血病單抗過程中獲得的鼠抗人抗體，經國際人類白細胞分化抗原協作組（HLDA-8）鑑定性質未明。前期研究表明其識別的抗原是一早期、穩定的T細胞活化分子，具有介導抗體在不同溫度下快速內化的能力。本課題中首先構建了Raji細胞的T7噬菌體cDNA文庫，利用2B8a抗體對文庫進行親和淘洗，挑取噬斑進行基因測序，測序所得序列經比對後最為匹配的為NPIPB3，但該蛋白與2B8a抗原性質不相符。因此，我們通過蛋白途徑進一步鑑定抗原。我們通過免疫共沉澱技術利用2B8a抗體從Raji細胞的蛋白裂解液中沉澱出2B8a抗原及其相互作用蛋白，二維電泳後將目的蛋白條帶送混合蛋白經串聯質譜分析後發現該抗原與coronin-1a匹配的可能性大。同時，利用2B8a抗體對噬菌體隨機肽庫進行篩選亦提示2B8a抗體所識別的抗原表位可能存在於coronin蛋白中。我們通過RT-PCR 法從Raji細胞中克隆出coronin-1a基因序列，插入到pcDNA3.1(+)質粒載體中，轉染CHO細胞以表達該蛋白，發現轉染coronin-1a的CHO胞漿內2B8a抗體結合蛋白顯著增加，提示2B8a抗體識coronin-1a。同時，通過對2B8a內化機制的研究發現，2B8a介導的抗體內化與細胞膜的功能密切相關，而與dynamin內化途徑及F-actin的功能無明顯關聯。然後，我們利用人組織晶片分析了2B8a抗體的反應譜，發現該抗體僅與扁桃體、淋巴結、胸腺、脾臟和骨髓等淋巴器官反應，而與心腦肝腎等重要臟器均不反應，但該抗體與B系白血病細胞的反應性明顯強於正常B細胞。此外，該抗體與活化T細胞相關的免疫性疾病患者外周血T細胞的反應性明顯增強，同時可介導對B系腫瘤細胞和活化T細胞的殺傷，具有開發成為靶向藥物的潛能。因此，我們利用通用引物從2B8a 雜交瘤細胞株中克隆出了2B8a 抗體的輕鏈和重鏈可變區序列，將用於單鏈抗體的構建和抗體人源化改造。該課題成功鑑定出2B8a抗體識別的抗原為冠蛋白coronin-1a，並發現該抗體具有用於靶向治療B系血液腫瘤和自身免疫性疾病的潛能，為將該抗體開發成為腫瘤靶向藥物奠定了基礎。
