新基因Mipu1抗心肌細胞凋亡的分子機制研究

《新基因Mipu1抗心肌細胞凋亡的分子機制研究》是依託中南大學，由蔣磊擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：新基因Mipu1抗心肌細胞凋亡的分子機制研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：蔣磊
• 依託單位：中南大學

項目摘要

近年申請者所在實驗室採用抑制消減雜交技術篩選並克隆了一個大鼠心肌缺血預適應誘導表達上調新基因Mipu1，並發現Mipu1在心肌缺血、氧化應激時表達明顯增加，具有明確的心肌細胞保護功能。但目前對其保護機制尚不明了。申請者最近確定了新基因Mipu1是轉錄因子，並確定了其特異的DNA結合序列。此外，通過生物信息學軟體發現多個促凋亡基因啟動子含有Mipu1結合位點，結合對國內外相關文獻的深入分析，篩選出10個可能受Mipu1調節並參與心肌缺血缺氧損傷的促凋亡基因。在上述研究基礎上，本項目擬採用EMSA、target detection assay、Western blot、ChIP、報告基因等目前國際上研究基因調控和基因功能的新技術，從對促凋亡基因的調控系統深入地探討Mipu1的心肌細胞保護機制，以進一步揭示心肌內源性保護的分子機理，為相關心血管疾病的防治提供新的思路。

結題摘要

本項目根據新基因Mipu1對心肌細胞的保護與促生長作用及其作為轉錄因子的特點，對其抗心肌細胞凋亡的功能與分子機制進行了深入的研究。採用過氧化氫與TNF-α誘導H9c2的凋亡作為細胞模型，流式細胞術、細胞核染色觀察及Caspase3測定等多個凋亡檢測指標，發現Mipu1能顯著地抑制過氧化氫與TNF-α誘導的H9c2細胞的凋亡。生物信心學分析了多個促凋亡基因的啟動子區，將啟動子區含有Mipu1結合位點的促凋亡基因進行深入研究。首先體外克隆Bax啟動子DNA序列，缺失突變製備融合蛋白，採用target detection assay研究發現，Mipu1最後的六個鋅指是其與DNA結合位點結合的結構域；採用免疫共沉澱發現，Mipu1能與KAP-1相互作用， KRAB是其與KAP-1相互作用的結構域。採用target detection assay發現，Mipu1純化蛋白能與Bax啟動子在體外結合；採用ChIP研究發現，Mipu1能在細胞內與Bax啟動子結合，但這種結合作用需要過氧化氫的介導；採用報告基因結合突變分析發現，Mipu1能顯著抑制Bax啟動子的活性，並且這種抑制作用依賴於Mipu1結構的完整性及其結合位點；採用RT-PCR(real-time PCR)及Western blot分析發現，過氧化氫能誘導Bax的表達，但其表達受Mipu1的抑制。這些研究結果說明，Bax是Mipu1的下游基因，受Mipu1的直接調控。採用類似的策略，我們進一步研究發現，Bid和Fas也受到Mipu1的直接調控，是其下游靶基因。除此之外，我們還發現抗凋亡基因Bcl-2的表達能被Mipu1促進，但其機制尚不清楚。綜合以上的研究結果，本項目有如下發現：1、Mipu1最後六個鋅指是其DNA結合結構域；2、Mipu1是一個抗凋亡蛋白，能抑制過氧化氫等誘導的凋亡；3、Bax、Bid和Fas是其下游基因，其表達受到Mipu1的抑制，並且促進Bcl-2的表達。因而Mipu1的抗凋亡功能主要是通過其對促凋亡基因Bax、Bid及Fas的抑制作用與抗凋亡基因Bcl-2表達的促進作用實現的。本項目的研究提示Mipu1是潛在的心肌細胞保護基因，可能在心肌內源性保護及缺血/缺血-再灌損傷中發揮了重要作用。