《新型NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶催化機理及套用基礎研究》是依託山東大學，由高超擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：新型NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶催化機理及套用基礎研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：高超
- 依託單位：山東大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
NAD非依賴性乳酸脫氫酶（iLDH）涉及微生物致病過程、2-酮基羧酸與手性羥基羧酸的生物催化法生產。申請者前期在假單胞菌乳酸代謝及L-iLDH的套用基礎研究過程中發現，施氏假單胞菌SDM中存在一種新型D-iLDH。與已報導的D-iLDH相比，SDM中新型D-iLDH除含一FAD結合結構域外，另含一鐵硫簇結合結構域，因而其催化機理與電子傳遞過程可能具有獨特之處。本申請擬以菌株SDM為研究對象，敲除D-iLDH編碼基因，確定新型D-iLDH在SDM菌株D-乳酸代謝中的關鍵作用；外源表達並分離純化該新型D-iLDH，通過圓二色譜、電子順磁共振、等溫滴定量熱及生物大分子相互作用分析等技術確定D-iLDH各結構域的生物學功能；分析該新型D-iLDH獲取及傳遞電子的具體過程，闡明該新型D-iLDH催化D-乳酸氧化的具體機理；為拓展D-iLDH在2-酮基羧酸與手性羥基羧酸生產方面的套用奠定理論基礎。
結題摘要
NAD非依賴性乳酸脫氫酶（iLDH）涉及微生物致病過程、2-酮基羧酸與手性2-羥基羧酸的生物催化法生產。申請者前期在假單胞菌乳酸代謝及NAD非依賴性L-乳酸脫氫酶（L-iLDH）的套用基礎研究中發現，假單胞菌中存在一種新型NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶（D-iLDH）。與已報導的D-iLDH相比，假單胞菌中D-iLDH除含一FAD結合結構域外，另含一鐵硫氧化還原酶結構域，其催化機理與電子傳遞過程可能具有獨特之處。本項目以環境微生物模式菌株Pseudomonas putida KT2440為研究對象，敲除該菌株中D-iLDH編碼基因lldE，確定D-iLDH在P. putida KT2440的D-乳酸分解代謝中發揮重要作用。外源表達並分離純化P. putida KT2440中D-iLDH、FAD結合結構域、鐵硫氧化還原酶結構域，通過對各蛋白的酶學性質及關鍵胺基酸位點的突變分析，確定P. putida KT2440的D-iLDH中FAD結合結構域負責D-乳酸的結合與催化D-乳酸脫氫，而鐵硫氧化還原酶結構域負責FAD結合結構域獲取電子的傳遞及將D-iLDH錨定於細胞膜上的功能。手性2-羥基羧酸與2-酮基羧酸均為重要的化學中間體，本項目通過對P. putida KT2440的基因工程改造，成功利用該菌株中D-iLDH催化2種外消旋2-羥基羧酸（乳酸與2-羥基丁酸）生產相應的2-酮基羧酸與L-2-羥基羧酸。考慮到P. putida KT2440中D-iLDH存在底物譜窄、不能以氧氣為電子受體等問題，其套用受到限制，本項目基於對P. putida KT2440中D-iLDH的催化機理的認識，從D-iLDH同源蛋白中經過系統篩選，獲得一種新的D-iLDH—D-乳酸氧化酶。後續利用D-乳酸氧化酶為催化劑，實現了拆分一系列2-羥基羧酸生產相應的2-酮基羧酸與L-2-羥基羧酸的目的。
