新型蛋白CkND在棉花抗病中的功能及其調控分子機理解析

《新型蛋白CkND在棉花抗病中的功能及其調控分子機理解析》是依託中國農業大學，由侯玉霞擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：新型蛋白CkND在棉花抗病中的功能及其調控分子機理解析
• 依託單位：中國農業大學
• 項目負責人：侯玉霞
• 項目類別：面上項目

項目摘要

棉花黃萎病已成為制約棉花產量提高和品質改善的主要障礙，為培育棉花抗病品種奠定理論基礎，申請者已經利用蛋白組學策略從荒漠植物-牛心朴子草中分離出抗病新蛋白CkND，CkND對棉花黃萎病菌菌絲生長以及孢子萌發具有顯著地抑制作用，轉35S::CkND基因擬南芥植株生長良好，抗病性增強。.申請者擬構建CaMV35S啟動子控制的CkND基因超表達和RNAi抑制表達載體，把載體導入農桿菌，以新陸早33為受體進行棉花遺傳轉化，對CkND表達水平變化的轉35S::CkND和35S::CkND RNAi植株進行研究，分析棉花與Verticillium dahliae 親和性表型、病害症狀發展與CkND轉錄激活水平變化，揭示黃萎病菌侵染過程中CkND蛋白水平的動態變化以及CkND表達量與棉花抗病性的關係。採用微觀機制與巨觀表型相結合，不同組織與整體對抗病回響相結合，解析新蛋白CkND抗棉花黃萎病的機理。

結題摘要

棉花黃萎病、枯萎病已成為制約棉花產量提高和品質改善的主要障礙，為提供抗病基因資源和培育棉花抗病品種奠定理論基礎，2011-2013年研究小組利用蛋白組學策略從荒漠植物-牛心朴子草分離純化抗病新蛋白CkND（CkTLP），蛋白CkND對黃萎病菌菌絲生長抑制效果為87.50％，對孢子萌發抑制率為100%，對棉花黃萎病菌和枯萎病菌具有顯著抑菌活性。為了研究新型蛋白CkND在棉花抗病中的功能及其調控分子機理，根據nano-ESI-MS/MS測定4個肽段的胺基酸序列，克隆出CkND基因（GenBank NO：GU067481）。CkND基因在ABA、SA、MeJA、NaCl和乾旱脅迫下，CkND轉錄激活水平顯著提高。CkND基因通過農桿菌介導法分別轉入擬南芥和棉花（品種為新陸早33），證實CkND基因整合到擬南芥、棉花基因組中，且穩定表達。CkND∷GFP融合蛋白定位於擬南芥細胞壁。棉花黃萎病菌侵染植株30d後，轉CkND基因擬南芥比野生型擬南芥的發病率降低42.7%；轉CkND基因棉花（F2代）比野生型棉花的發病率降低62.9%，7d後轉基因棉花與黃萎病菌親和性表型降低，非轉基因棉花病害症狀加重。在病圃2年試驗表明，轉CkND基因棉花對黃萎病菌表現出高水平抗性，通過單遺傳控制黃萎病菌生長，異核不親和性的菌絲體死亡，異核體不親和性是一個受CkND基因調控的過程。CkND蛋白含有酸性凹槽和疏水表面可能是CkND蛋白抑菌活性位點。構建牛心朴子草cDNA文庫，通過酵母雙雜交系統檢測到CkND和CkANN兩種蛋白相互作用，通過研究發現CkND和CkChn134具有協同作用導致黃萎病菌和棉花的不親和性反應。把CkND和CkChn134基因的雙價載體pZZZ-CkND-Chn轉入棉花（新陸早33），轉雙價基因棉株抗黃萎病菌和枯萎病的能力高於轉單價基因棉花植株抗病能力。CkANN通過調控過氧化物酶的活性，誘導PR-1、Chn134和葡聚糖酶基因的表達，獲得轉基因棉花黃萎病、枯萎病的高抗性。揭示了抗病蛋白相互作用的途徑，抵抗棉花黃萎病菌菌絲的擴展，最終控制棉花黃萎病、枯萎病。結果表明CkND蛋白不僅直接抑制病原菌菌絲的生長和孢子萌發，而且在轉基因棉花中CkND基因調控植株對棉花黃萎病、枯萎病抗性。