新型腎癌循環腫瘤細胞的檢測及單細胞分析的研究

《新型腎癌循環腫瘤細胞的檢測及單細胞分析的研究》是依託蘭州大學，由田俊強擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：新型腎癌循環腫瘤細胞的檢測及單細胞分析的研究
• 依託單位：蘭州大學
• 項目負責人：田俊強
• 項目類別：面上項目

項目摘要

腎癌循環腫瘤細胞（CTC）與腎癌的轉移密切相關，CTC的檢測增進了我們對於惡性腫瘤轉移過程的理解。但目前尚無一種方法可完全解決假陽性或假陰性較高的問題。本研究將根據當前腫瘤特異性複製缺陷型腺病毒和單細胞分析的最新進展，構建碳酸酐酶IX（CAIX）啟動子控制的腫瘤特異性GFP報告基因腺病毒。該腺病毒的複製必需結構E1A受控於CAIX啟動子，並用GFP取代E3結構，使得該腺病毒僅僅能夠在腎癌腫瘤細胞內複製而不能在正常細胞中複製。並套用CD45染色排除技術消除白細胞影響,計數並顯微操作獲取GFP+/CD45-細胞。結合當前最先進的單細胞分析技術，從基因水平檢測CTC與正常腎組織的差異。本研究如獲得成功，將開發出一種全新的CTC檢測及分析技術，最大限度降低假陰性和假陽性。為準確檢測CTC並予分析，為CTC檢測提供新思路。本研究對早期發現腎癌的惡性侵襲、腫瘤的治療監測、患者的預後評估等具有重要意義。

結題摘要

腎癌(RCC)，又稱為腎細胞癌、腎腺癌，起源於泌尿小管上皮。統計表明，RCC確診時已有30%—40%發生遠處轉移。循環腫瘤細胞定植在器官就造成了腫瘤的播散轉移——這種觀點已經得到全世界腫瘤學家的廣泛承認。血液中檢測到循環腫瘤細胞(Circulating Tumor Cells, CTC)並不意味著有遠處轉移，但發生轉移的機率將大大增加。根據分離得到的CTC進行生物學分析，對進入CTC發生遠處種種植的可能性進行預判，將對腎癌的診斷、治療、預後判斷具有重大的意義。本課題在國家自然科學基金的資助下，成功構建了腎細胞癌腫瘤特異性啟動子CAIX。通過分子生物學實驗技術，成功構建了包含腎癌啟動子的Rp-CAIX-E1A作為穿梭質粒。T-IRES-HrGFP作為報告基因（1301bp）、對穿梭治療進行改造為Rp-CAIX-E1A-IRES-HrGFP，使其具有了綠色螢光報告基因及IRES強啟動子。套用同源重組技術成功構建重組質粒AdEasy-1- CAIX-E1A- IRES-HrGFP。套用脂質體病毒包裝系統，在293包裝細胞中，完成第5型腎癌組織特異性報告基因腺病毒Ad5- CAIX-E1A- IRES-HrGFP的包裝過程。通過病毒操作技術，完成了腺病毒的擴增、純化、鑑定和滴度測定。套用人白血病細胞 K562作為白細胞背景，檢測了少量混入的腎癌細胞ACHN,A-498, 786-0，檢測到了確切的螢光信號。實驗達到了預期效果。