拮抗木黴菌碳代謝抑制因子對ABC轉運蛋白調控機理

《拮抗木黴菌碳代謝抑制因子對ABC轉運蛋白調控機理》是依託上海交通大學，由李雅乾擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：拮抗木黴菌碳代謝抑制因子對ABC轉運蛋白調控機理
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：李雅乾
• 依託單位：上海交通大學

項目摘要

木黴菌ABC轉運蛋白依賴水解ATP能量推動物質運輸，減少對自身毒害並提高拮抗特性。碳代謝抑制因子可全局性調控生長代謝相關基因表達，直接抑制水解酶基因的轉錄，誘導ABC轉運蛋白表達。本研究採用深綠木霉T23菌株，結合生物信息學和分子遺傳操作技術，探索木黴菌碳代謝抑制子cre1 調控ABC轉運蛋白（Taabc2）表達的分子機理。首先通過cre1和Tabbc2基因結構特徵分析，cre1對菌絲生長和形態、ATP及水解酶活性變化的測定，確定Cre1參與調控 Taabc2基因表達可能途徑。其次，確定Taabc2基因轉錄起始位點，定量分析Cre1對啟動子區域不同長度序列表達量的影響，確定二者相互作用的關鍵區域。最後克隆表達CRE1蛋白，查找 CRE1與Taabc2作用位點。闡明CRE1與 ABC轉運蛋白互作的分子特徵，揭示木黴菌Cre1調控新的功能，建立Cre1介導的轉運蛋白和水解酶三者調控網路圖。

結題摘要

木黴菌(Trichoderma.spp)是土壤及植物根系生態環境中廣泛存在的絲狀真菌，具拮抗植物病原菌，促進植物的生長。真菌碳代謝抑制具有多種調控模式和途徑，主要在轉錄層面通過一種鋅指蛋白(Cys2His2) 激活其效應蛋白活性及穩定性等過程。轉錄組表明：木黴菌中碳代謝抑制子CRE1全局性調控細胞生長代謝過程，保障木霉在不同生境中的存活及拮抗病原菌特性。本研究以拮抗深綠木霉T.atroviride 23為研究對象，採用生物信息學和分子遺傳操作相結合策略，利用農桿菌介導的遺傳轉化技術（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT）敲除其碳代謝抑制因子CRE1。比較突變株（∆cre1）與野生株（wide type, WT）的生長性狀，初步探明cre1基因是調控深綠木黴菌菌絲生長、發育和代謝的全局性轉錄因子。cre1基因沉默後，∆cre1較WT菌絲生長變慢，產孢滯後，且cre1調控菌絲和產孢特性依賴於培養基組分。此外，碳代謝因子CRE1還間接調控木黴菌代謝相關基因的表達：cre1基因抑制幾丁質酶、β-1,3-葡聚糖酶基因轉錄，調控與抗生素和毒素合成密切相關的非核糖體肽合成酶（NPRS）和聚酮合成酶基因（PKS）的表達。深入探究CRE1對參與代謝產物運輸相關的ABC轉運蛋白taabc2的誘導表達調控機制，系統分析Taabc2基因轉錄啟動子區域在野生株和突變株中的表達情況，確定CRE1與Taabc2編碼基因啟動區的兩個位點直接作用的關鍵區域，分別是啟動子上游538和570位點，另一個位點337也是潛在的結合位點。利用原核表達系統獲得CRE1蛋白，通過凝膠阻滯試驗進而確定了CRE1和Taabc2啟動子結合的直接證據，明確CRE1誘導Taabc2表達，間接影響某些重要代謝產物運輸以及增加菌株自身的抗藥性。 綜上，深綠木霉T23的碳代謝因子CRE1作為一個全局性轉錄調控因子，抑制菌絲的生長發育，調控代謝及其產物運輸相關的基因，誘導ABC轉運蛋白taabc2基因的表達，在木黴菌-病原菌互作中起到關鍵的作用。本研究指導以CRE1為靶標，提高木黴菌細胞壁降解酶及生防相關次級代謝產物的合成和分泌，提高木黴菌生防效果具有重要意義。