抗HIF-1α納米抗體靶向治療胰腺癌的實驗研究

《抗HIF-1α納米抗體靶向治療胰腺癌的實驗研究》是依託天津大學，由黃鶴擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：抗HIF-1α納米抗體靶向治療胰腺癌的實驗研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：黃鶴
• 依託單位：天津大學

項目摘要

乏氧誘導因子-1α(HIF-1α)是一個缺氧狀態下發揮活性的核轉錄因子，最新文獻報導和申請者前期工作中發現HIF-1α組成型表達於胰腺癌細胞。以往常規抗體靶向亞細胞部位困難，無法作為胞內抗體通過阻斷HIF-1α通路來治療胰腺癌。申請者前期製備的澳洲羊駝alpaca納米抗體（nanobody）大小僅為完整抗體的十分之一，且不具有化學疏水性，其抗熱性和抗酸鹼性更強，在還原環境中仍能很好的維持其抗原結合能力。為此，申請者提出以HIF-1α為靶標,篩選得到anti-HIF-VHH binder；在此基礎上，本研究擬構建編碼細胞核定位的anti-HIF-VHH胞內抗體基因的真核表達載體，轉染胰腺癌細胞，觀測其表達、定位及抑瘤效應，來探討納米抗體作為細胞內抗體用於特異性阻斷靶蛋白、發揮抗腫瘤作用的可行性；並構建人胰腺癌裸鼠模型進行體內實驗，以進一步驗證該抗體療效,為胰腺癌的生物治療提供新思路和新靶點。

結題摘要

在胰腺癌的腫瘤微環境當中，以上位調控因子HIF-1為主導的轉錄調控機制在胰腺癌細胞增殖，轉移，耐藥等多重生物學行為中起到了至關重要的作用。本課題旨在開發anti-HIF-1α VHH胞內抗體，用於特異性拮抗乏氧誘導因子的亞基HIF-1α，從而抑制在胰腺癌中因為HIF-1高表達造成的腫瘤耐藥效應，促進腫瘤對化療藥物的敏感性，進而調節胰腺腫瘤免疫微環境的重塑，以期達到提高患者預後的目的。首先利用多種駝科動物外周血淋巴細胞，構建高庫容的納米抗體天然庫，並使用噬菌體展示技術和核糖體展示技術篩選得到對HIF-1α的PAS-B抗原決定簇具有較高親和力的納米抗體序列。與此同時，嘗試了利用通過高通量測序比對構建的模擬納米抗體合成文庫進行anti-HIF-1α binder的篩選工作。為滿足後續的實驗需要，我們初步搭建了適宜納米抗體的體外親和力平台，對篩選得到的納米抗體序列進行體外親和力成熟，從而得到了親和力更高，熱穩定性更強的突變體序列VHH212-mut。在此基礎上對最佳化的納米抗體序列進行進一步的修飾工作，提高其異源表達產量和穩定性。進而通過WB，SPR和Pull Down實驗，驗證VHH212-mut的親和力和免疫活性，並通過計算機分子模擬技術闡述VHH212-mut在胰腺癌細胞系內對HIF-1α拮抗的分子動力學機制。隨後最佳化anti HIF-1α VHH 胞內抗體的真核表達載體，在乏氧條件下套用WB，Q-PCR，雙螢光素酶報告基因等實驗手段驗證anti HIF-1α VHH 胞內抗體能夠拮抗HIF-1α，從而阻斷乏氧誘導因子-1的轉錄調控作用。最後通過構建BALB/c裸鼠異種移植模型，進一步證明了阻斷HIF-1α的轉錄調控作用能夠增加腫瘤對於胰腺癌一線化療藥物吉西他濱的敏感性。本項目研究成果為胰腺癌腫瘤的生物治療提供了新的思路，同時也為靶向胰腺導管腺癌的腫瘤臨床精準治療提供了理論基礎。