《抗肝癌新靶點ASB3 E3泛素連線酶抗癌效應及分子機制研究》是依託復旦大學，由楊冬琴擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：抗肝癌新靶點ASB3 E3泛素連線酶抗癌效應及分子機制研究
- 依託單位：復旦大學
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：楊冬琴
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
泛素-蛋白酶體系統是細胞內蛋白選擇性降解的重要途徑，其中的E3泛素連線酶負責特異性識別大量靶蛋白，近年發現其功能失調與腫瘤發生髮展密切相關，因此成為抗腫瘤藥物研發熱點。申請者通過目前國內外篩選RNAi文庫最新的高內涵技術在肝癌細胞上針對600種E3泛素連線酶RNAi文庫進行篩選，發現下調E3泛素連線酶底物識別蛋白ASB3可顯著抑制肝癌細胞生長，形態學出現凋亡樣改變，並誘導出典型的自噬表型，推測ASB3在肝癌生長中有重要作用，可能成為干預藥物靶點。在此基礎上，本課題擬全面闡明干預ASB3的抑制肝癌作用及其分子機制，重點鑑定ASB3的新底物，並在動物和臨床標本上驗證其臨床套用價值。預期結果有助於深入理解 E3泛素連線酶作為新型抗腫瘤靶點的分子機制，為研發抗肝癌新藥提供了依據。
結題摘要
本項目主要圍繞闡明ASB3 E3 泛素連線酶與肝癌患者臨床病理特徵的關係，通過體內外實驗驗證下調ASB3 抑制肝癌細胞生長的分子機制及抗癌效應。我們緊緊圍繞計畫展開了相關實驗，結果發現ASB3 蛋白在肝癌中較其癌旁組織呈顯著上調，提示ASB3具有抗癌靶點特徵；ASB3的表達量與患者血清中的AFP水平含量、腫瘤大小具有相關性，與患者的生存期及無復發生存期具有相關性，提示ASB3可能在促進肝癌的發生髮展有重要意義。通過MTS和建立LM6裸鼠皮下荷瘤鼠模型等方法在體內外驗證了下調ASB3能顯著抑制肝癌細胞的生長。機制上我們首次證明死亡受體DR5作為潛在底物在下調ASB3誘導的線粒體凋亡途徑中發揮重要作用，進一步證實下調ASB3既可以通過DR5泛素化也可以通過CHOP分別在蛋白和轉錄層面對DR5進行調控，從而發揮其抗癌效應。通過轉染DR5L特異性的siRNA，闡明DR5L在下調ASB3誘導線粒體凋亡中的關鍵作用。最後我們證實了細胞內高水平的DR5對下調ASB3抑制細胞增殖是必須的，並進一步闡明下調ASB3可以顯著增敏肝癌細胞對TRAIL的耐藥！細胞自噬和凋亡相互交叉影響調控腫瘤增殖，我們發現下調ASB3不僅促進線粒體凋亡而且顯著增強細胞自噬，機制上發現下調ASB3在蛋白層面上可以抑制Beclin1的表達，通過RNA干擾技術下調Beclin1可逆轉下調ASB3誘導的細胞凋亡。深入研究發現下調ASB3誘發caspase8的激活進一步促進Beclin1的C端發生剪下最終誘導線粒體凋亡，提示下調ASB3可以通過激活caspase8和beclin1的剪下來激活細胞內死亡途徑及放大細胞自噬效應，從而提出自噬激活劑與ASB3抑制劑的聯合套用的潛在套用價值。此外為深入挖掘ASB3的潛在底物，我們利用高質量的蛋白質修飾類抗體和富集材料，巧妙的修飾肽段富集方法、先進的LC-MS/MS系統和高級生物信息學分析系統解析了ASB3的潛在底物的泛素化水平，結果一共檢測到了2195個蛋白上的共5299個修飾位點，其中發現有248個蛋白泛素化水平顯著增加，另外有381個蛋白泛素化水平顯著降低。該部分數據結果有待於在後續工作中進一步證實和發現。綜上這些實驗數據充分肯定了ASB3在肝癌中的重要作用及套用價值。
