抗凝絮作用，套用物理或化學方法，除掉或抑制血液中的某些凝血因子，阻止血液凝固，稱為抗凝。能夠阻止血液凝固的化學試劑或物質，稱為抗凝劑或抗凝物質。
基本介紹
- 中文名：抗凝絮作用
- 原理：使凝血酶原不能激活
- 離心設備：離心機等
- 離心分離方法：差速離心法等
如天然抗凝劑（肝素，水蛭素等）
Ca+2鰲合劑（檸檬酸鈉，氟化鉀）
原理：使凝血酶原不能激活，Ca+2是凝血因子IV，其他的是蛋白類》.
離心技術是根據顆粒在勻迷圓周運動時受到一個外向的離心力的行為發展起來的一種分離分析技術。
1．用於工業生產的，如化工、製藥、食品等工業大型製備用的離心技術，轉速都在每分鐘5000轉以下。
2．用於生物、醫學、化學等實驗室分析研究的，轉速從每分鐘幾千到幾萬轉以上，此類技術的使用目的在於分離和純化樣品，以及對純化樣品的有關性能進行研究。
一、基本原理
1．離心力Centrifugalforce(F)
F=mω2r
ω：旋轉角速度(弧度/秒)r:旋轉體離旋轉軸的距離(cm)
m：顆粒質量
2．相對離心力Relativecentrifugalforce(RCF)
RCF就是實際離心力轉化為重力加速度的倍數
RCF=F離心力/F重力
=mω2r/mg=ω2r/g
g為重力加速度(980．70g/sec2)
同為轉於旋轉一周等於2π弧度，因此轉子的角速度以每分鐘旋轉的次數(每分鐘轉數n或r/min)表示：
一般情況下，低速離心時常以r/min來表示，高速離心時則以g(或數字Xg)表示。
用“Xg”表示每分鐘轉速可以真實反映顆粒在離心管不同位置的離心力。Dole&Cotzias製作了轉子速度和半徑相對應的離心力列線圖(圖2—15)。
用“Xg”表示每分鐘轉速可以真實反映顆粒在離心管不同位置的離心力。Dole&Cotzias製作了轉子速度和半徑相對應的離心力列線圖(圖2—15)。
3．沉降係數Sedimentationcoefficient(S)
當轉子內樣品繞著旋轉軸離心時，樣品沉降率是由樣品顆粒的大小、形狀、密度和溶劑的粘度、密度以及離心加速度決定的，在一般情況下，樣品的沉降特徵可以用沉降係數來表示：
S：是指單位離心場中粒子移動的速度。
當轉子內樣品繞著旋轉軸離心時，樣品沉降率是由樣品顆粒的大小、形狀、密度和溶劑的粘度、密度以及離心加速度決定的，在一般情況下，樣品的沉降特徵可以用沉降係數來表示：
S：是指單位離心場中粒子移動的速度。
S的物理意義是顆粒在離心力作用下從靜止狀態到達等速運動所經過的時間。
S在實際套用時常在10-13秒左右，故把沉降係數10-13秒稱為一個Svedberg單位，簡寫S，單位為秒，1S二1×10-13秒。對一定的樣品，在一定的介質中，樣品沉降係數S也常保持不變。文獻中常用沉降係數以描述某些生物大分子或亞細胞器大小。
二、離心設備
離心技術所使用的設備是由離心轉子、離心管及附屬檔案等組成。
(一)離心機
1.低速離心機
一般最高轉速在6000r/min以下。實驗室中常用於分離製備。
2．高速離心機帶有能夠冷卻的離心腔製冷設備，這類離心機的速度控制比上述的低速離心機來得準確，工作時的實際速度和溫度可通過儀表顯示；配有一定類型及規格的轉子，可根據需要選用。此類離心機的最高轉速在25000r/min以下，常用於生物大分子的分離製備。
3．超速離心機由四個部分組成，即驅動和速度控制；溫度控制；真空系統以及轉於。至今超迷離心機最高轉速為85000-/min(可達600，000g左右)。常用於分離亞細胞器、病毒粒於、DNA、RNA和蛋白質分於，在分離時無須加入可能引起被分離物質結構改變的物質，故為觀察它們的“天然”結構與功能提供了手段。
(二)轉子
主要有三種：
固定角式轉子(fixed—anglerotor)；水平轉子(swing—outrotor)；垂直轉子(verticalrotor)，還有帶狀轉子(zonalrotor)和連續轉於(continuousrotor)等。
1．固定角式轉子離心管在離心機中放置的位置與旋轉軸心形成一個固定的角度，角度變化在14—40°之間，常見的角度有20°、28°、34°及40°等。
因角式轉子的重心低，轉速可較高，樣品粒子穿過溶劑層的距離略大於離心管的直徑；又因為有一定的角度，故在離心過程中撞到離心管外壁的粒子沿著管壁滑到管底形成沉澱，這就是“管壁效應”，此效應使最後在管底聚成的沉澱較緊密。
2．水平轉於此類轉於靜止時，處在轉子中的離心管中心線與旋轉軸平行，而在轉子旋轉加速時，離心管中心線由平行位置逐漸過渡到垂直位置，即與旋轉軸成90‘角，粒子的沉澱方向同旋轉半徑方向基本一致，但也有少量的“管壁效應”。
由於此類轉予的重心位置較高，樣品粒子沉降穿過溶劑層的距離大於直徑。它對於多種成分樣品分離特別有效，常用於速率區帶離心和等密度離心。
3．垂直轉子離心管垂直插入轉於孔內，在離心過程中始終與旋轉軸子行，而離心時液層發生90°角的變化，從開始的水平方向改成垂直方向，轉子降速時，垂直分布的液層又逐漸趨向水平，待旋轉停止後，液面又完全恢復成水平方向。這是因為在進行密度梯度離心前，由於重力的作用，垂直轉予的粒子沉澱距離等於離心管的直徑，離心分離所徭的離心力最小，適用於速率區帶離心和等密度離心，但一般不用於差速離心。
三、離心分離方法
根據離心原理，按照實際工作的需要，目前已有可設計出各種離心方法綜合起來大致可分三類
1.平衡離心法根據粒子大小、形狀不同進行分離，包括差速離心法(differentialvelocitycentrifugation)和速率區帶離心法(ratezonalcentrifugation)。
2．等密度離心法(isopyniccentrifugation)又稱等比重離心法，根據粒子密度差進行分離，等密度離心法和上述速率區帶離心法合稱為密度梯度離心法。
3．經典式沉降平衡離心法用於對生物大分子分子量的測定、純度估計、構象變化。
(一)差速離心法
它利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對離心力，使一個非均勻混合液內的大小、形狀不同的粒子分步沉澱。操作過程中一般是在離心後傾倒的辦法把上清液與沉澱分開，然後將上清液加高轉速離心，分離出第二部分沉澱，如此往復加高轉速，逐級分離出所需要的物質。
差速離心的解析度不高，沉澱係數在同一個數量級內的各種粒子不容易分開，常用於其他分離手段之前的粗製品提取。
2．注意點：
①可用角式、水平式轉頭
②可用剎車
③難以獲得高純度
例：用差速離心法分離已破碎的細胞各組份
S在實際套用時常在10-13秒左右，故把沉降係數10-13秒稱為一個Svedberg單位，簡寫S，單位為秒，1S二1×10-13秒。對一定的樣品，在一定的介質中，樣品沉降係數S也常保持不變。文獻中常用沉降係數以描述某些生物大分子或亞細胞器大小。
二、離心設備
離心技術所使用的設備是由離心轉子、離心管及附屬檔案等組成。
(一)離心機
1.低速離心機
一般最高轉速在6000r/min以下。實驗室中常用於分離製備。
2．高速離心機帶有能夠冷卻的離心腔製冷設備，這類離心機的速度控制比上述的低速離心機來得準確，工作時的實際速度和溫度可通過儀表顯示；配有一定類型及規格的轉子，可根據需要選用。此類離心機的最高轉速在25000r/min以下，常用於生物大分子的分離製備。
3．超速離心機由四個部分組成，即驅動和速度控制；溫度控制；真空系統以及轉於。至今超迷離心機最高轉速為85000-/min(可達600，000g左右)。常用於分離亞細胞器、病毒粒於、DNA、RNA和蛋白質分於，在分離時無須加入可能引起被分離物質結構改變的物質，故為觀察它們的“天然”結構與功能提供了手段。
(二)轉子
主要有三種：
固定角式轉子(fixed—anglerotor)；水平轉子(swing—outrotor)；垂直轉子(verticalrotor)，還有帶狀轉子(zonalrotor)和連續轉於(continuousrotor)等。
1．固定角式轉子離心管在離心機中放置的位置與旋轉軸心形成一個固定的角度，角度變化在14—40°之間，常見的角度有20°、28°、34°及40°等。
因角式轉子的重心低，轉速可較高，樣品粒子穿過溶劑層的距離略大於離心管的直徑；又因為有一定的角度，故在離心過程中撞到離心管外壁的粒子沿著管壁滑到管底形成沉澱，這就是“管壁效應”，此效應使最後在管底聚成的沉澱較緊密。
2．水平轉於此類轉於靜止時，處在轉子中的離心管中心線與旋轉軸平行，而在轉子旋轉加速時，離心管中心線由平行位置逐漸過渡到垂直位置，即與旋轉軸成90‘角，粒子的沉澱方向同旋轉半徑方向基本一致，但也有少量的“管壁效應”。
由於此類轉予的重心位置較高，樣品粒子沉降穿過溶劑層的距離大於直徑。它對於多種成分樣品分離特別有效，常用於速率區帶離心和等密度離心。
3．垂直轉子離心管垂直插入轉於孔內，在離心過程中始終與旋轉軸子行，而離心時液層發生90°角的變化，從開始的水平方向改成垂直方向，轉子降速時，垂直分布的液層又逐漸趨向水平，待旋轉停止後，液面又完全恢復成水平方向。這是因為在進行密度梯度離心前，由於重力的作用，垂直轉予的粒子沉澱距離等於離心管的直徑，離心分離所徭的離心力最小，適用於速率區帶離心和等密度離心，但一般不用於差速離心。
三、離心分離方法
根據離心原理，按照實際工作的需要，目前已有可設計出各種離心方法綜合起來大致可分三類
1.平衡離心法根據粒子大小、形狀不同進行分離，包括差速離心法(differentialvelocitycentrifugation)和速率區帶離心法(ratezonalcentrifugation)。
2．等密度離心法(isopyniccentrifugation)又稱等比重離心法，根據粒子密度差進行分離，等密度離心法和上述速率區帶離心法合稱為密度梯度離心法。
3．經典式沉降平衡離心法用於對生物大分子分子量的測定、純度估計、構象變化。
(一)差速離心法
它利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對離心力，使一個非均勻混合液內的大小、形狀不同的粒子分步沉澱。操作過程中一般是在離心後傾倒的辦法把上清液與沉澱分開，然後將上清液加高轉速離心，分離出第二部分沉澱，如此往復加高轉速，逐級分離出所需要的物質。
差速離心的解析度不高，沉澱係數在同一個數量級內的各種粒子不容易分開，常用於其他分離手段之前的粗製品提取。
2．注意點：
①可用角式、水平式轉頭
②可用剎車
③難以獲得高純度
例：用差速離心法分離已破碎的細胞各組份
(二)速率區帶離心法
1．原理
速率區帶離心法是離心前在離心管內先裝入密度梯度介質(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)，待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心。離心後在近旋轉軸處的介質密度最小，離旋轉軸最遠處介質的密度最大，但最大介質密度必須小於樣品中粒於的最小密度。這種方法是根據分離的粒子其在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子處於不同的密度梯度層內分成一系列區帶，達到彼此分離的目的。
梯度液在離心過程中以及離心完畢後，取樣時起著支持介質和穩定劑的作用，避免因機械振動而引起已分層的粒子再混合。
該離心法的離心時間要嚴格控制，即有足夠的時間使各種粒子在介質梯度中形成區帶，又要控制在任意一個粒子達到沉澱前。如果離心時間過長，所有的樣品可全部到達離心管底部；離心時間不足，樣品還沒有分離。由於此法是一種不完全的沉降，沉降受物質本身大小的影響較大，一般是套用在物質大小相異而密度相同的情況。
2．注意點：
①嚴格控制離心時間
②粒子密度大於介質密度
③樣品事先配製在較平緩的連續密度的梯度溶液
④不能用角式轉頭、只能用水平式轉頭
⑤不能用剎車
(三)等密度離心法
1．原理
等密度離心法是在離心前預先配製介質的密度梯度，此種密度梯度液包含了被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在梯度液或和梯度液先混合，離心開始後，當梯度液由於離心力的作用逐漸形成底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時原來分布均勻粒子也發生重新分布。當管底介質的密度大於粒子的密度，粒子上浮；在彎頂處粒子密度大於介質密度時，則粒子沉降，最後粒子進入到一個它本身的密度位置即粒子密度等於介質密變，此時dr/dt為零粒子不再移動，粒子形成純組分的區帶，與樣品粒子的密度有關，而與粒子的大小和其他參數無關，因此只要轉速、溫度不變，則延長離心時間也不能改變這些粒子的成帶位置。
2．注意點：
①離心時間要長
②可用角式轉頭或水平式轉頭
③粒子密度相近或相等時不宜用
④密度梯度溶液中要包含所有粒子密度
⑤不能用剎車
四、梯度溶液的製備
(一)梯度材料的選擇原則：
1．與被分離的生物材料不發生反應，且易與所分離的生物材料分開。
2．可達到要求的密度範圍，且在所要求的密度範圍內，粘度低，滲透壓低，離子強度和pH變化較小。
3．不會對離心設備發生腐蝕作用。
4．容易純化，價格便宜或容易回收。
5．濃度便於測定，如具有折光率。
6．對於分析超迷離心工作來說，它的物理性質，熱力學性質應該是己知的。
(二)梯度材料的套用範圍下面簡單介紹幾種常用的密度梯度材料的性質及其套用範圍。
1．蔗糖：水溶性大，性質穩定，滲透壓較高，其最高密度可達1．33g/ml，且由於價格低，容易製備，是現在實驗室里常用於細胞器、病毒、RNA分離的梯度材料，但由於有較大的滲透壓，不宜用於細胞的分離。
2．聚蔗糖：商品名Ficoll，常採用Ficoll—400也就是相對分子重量為400000，Ficoll滲透壓低，但它的粘度卻特別高，為此常與泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用於分離各種細胞包括血細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞、鼠肝細胞等。
3．氯化銫：是一種離於性介質、水溶性大，最高密度可達1．91g/nd。由於它是重金屬鹽類，在離心時形成的梯度有較好的解析度，被廣泛地用於DNA、質粒、病毒和脂蛋白的分離，但價格較貴。
4．鹵化鹽類：KBr和NaCI可用於脂蛋白分離，KI和NaI可用於RNA分離，其解析度高於銫鹽。NaCl梯度也可用於分離脂蛋白，NaI梯度可分離天然或變性的DNA。
5．Percoll:是商品名，它是一種SiO2膠體外面包了一層聚乙烯吡咯酮(PVP)，滲透壓低，它對生物材料的影響小，而且顆粒穩定，在冷卻和凍融情況下還是穩定的。其粘度高，在酸性pH和高離子強度下不穩定。它可用於細胞、細胞器和病毒的分離。
五、分析性超速離心
與製備性超速離心不同的是：分析性超速離心主要是為了研究生物大分子的沉降特性和結構，而不是專門收集某一特定組分。因此它使用了特殊的轉子和檢測手段，以便連續地監視物質在一個離心場中的沉降過程。
分析性超速離心的工作原理：
分析性超速離心機主要由一個橢圓形的轉子，一套真空系統和一套光學系統所組成。該轉子通過一個柔性的軸聯接一個高速的驅動裝置，這軸可使轉於在旋轉時形成自己的軸。轉子在一個冷凍的真空腔中旋轉，其容納二個小室：分析室和配衡室有上下二個平面的石英窗，離心機中裝有的光學系統可保證在整個離心期間都能觀察小室中正在沉降的物質，可以通過對紫外光的吸收(如對蛋白質和DNA)或折射率的不同對沉降物進行監視，後一方法的原理是：當光線通過一個具有不同密度區的透明液時，在這些區帶的界面上產生光的折射。在分析室中物質沉降時重粒子和輕粒子之間形成的界面就象一個折射的透鏡，結果在檢測系統的照相底板上產生一“峰”。由於沉降不斷進行，界面向前推進，故“峰”也在移動，從峰移動的速度可以得到物質沉降速度的指標.
1．原理
速率區帶離心法是離心前在離心管內先裝入密度梯度介質(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)，待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心。離心後在近旋轉軸處的介質密度最小，離旋轉軸最遠處介質的密度最大，但最大介質密度必須小於樣品中粒於的最小密度。這種方法是根據分離的粒子其在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子處於不同的密度梯度層內分成一系列區帶，達到彼此分離的目的。
梯度液在離心過程中以及離心完畢後，取樣時起著支持介質和穩定劑的作用，避免因機械振動而引起已分層的粒子再混合。
該離心法的離心時間要嚴格控制，即有足夠的時間使各種粒子在介質梯度中形成區帶，又要控制在任意一個粒子達到沉澱前。如果離心時間過長，所有的樣品可全部到達離心管底部；離心時間不足，樣品還沒有分離。由於此法是一種不完全的沉降，沉降受物質本身大小的影響較大，一般是套用在物質大小相異而密度相同的情況。
2．注意點：
①嚴格控制離心時間
②粒子密度大於介質密度
③樣品事先配製在較平緩的連續密度的梯度溶液
④不能用角式轉頭、只能用水平式轉頭
⑤不能用剎車
(三)等密度離心法
1．原理
等密度離心法是在離心前預先配製介質的密度梯度，此種密度梯度液包含了被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在梯度液或和梯度液先混合，離心開始後，當梯度液由於離心力的作用逐漸形成底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時原來分布均勻粒子也發生重新分布。當管底介質的密度大於粒子的密度，粒子上浮；在彎頂處粒子密度大於介質密度時，則粒子沉降，最後粒子進入到一個它本身的密度位置即粒子密度等於介質密變，此時dr/dt為零粒子不再移動，粒子形成純組分的區帶，與樣品粒子的密度有關，而與粒子的大小和其他參數無關，因此只要轉速、溫度不變，則延長離心時間也不能改變這些粒子的成帶位置。
2．注意點：
①離心時間要長
②可用角式轉頭或水平式轉頭
③粒子密度相近或相等時不宜用
④密度梯度溶液中要包含所有粒子密度
⑤不能用剎車
四、梯度溶液的製備
(一)梯度材料的選擇原則：
1．與被分離的生物材料不發生反應，且易與所分離的生物材料分開。
2．可達到要求的密度範圍，且在所要求的密度範圍內，粘度低，滲透壓低，離子強度和pH變化較小。
3．不會對離心設備發生腐蝕作用。
4．容易純化，價格便宜或容易回收。
5．濃度便於測定，如具有折光率。
6．對於分析超迷離心工作來說，它的物理性質，熱力學性質應該是己知的。
(二)梯度材料的套用範圍下面簡單介紹幾種常用的密度梯度材料的性質及其套用範圍。
1．蔗糖：水溶性大，性質穩定，滲透壓較高，其最高密度可達1．33g/ml，且由於價格低，容易製備，是現在實驗室里常用於細胞器、病毒、RNA分離的梯度材料，但由於有較大的滲透壓，不宜用於細胞的分離。
2．聚蔗糖：商品名Ficoll，常採用Ficoll—400也就是相對分子重量為400000，Ficoll滲透壓低，但它的粘度卻特別高，為此常與泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用於分離各種細胞包括血細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞、鼠肝細胞等。
3．氯化銫：是一種離於性介質、水溶性大，最高密度可達1．91g/nd。由於它是重金屬鹽類，在離心時形成的梯度有較好的解析度，被廣泛地用於DNA、質粒、病毒和脂蛋白的分離，但價格較貴。
4．鹵化鹽類：KBr和NaCI可用於脂蛋白分離，KI和NaI可用於RNA分離，其解析度高於銫鹽。NaCl梯度也可用於分離脂蛋白，NaI梯度可分離天然或變性的DNA。
5．Percoll:是商品名，它是一種SiO2膠體外面包了一層聚乙烯吡咯酮(PVP)，滲透壓低，它對生物材料的影響小，而且顆粒穩定，在冷卻和凍融情況下還是穩定的。其粘度高，在酸性pH和高離子強度下不穩定。它可用於細胞、細胞器和病毒的分離。
五、分析性超速離心
與製備性超速離心不同的是：分析性超速離心主要是為了研究生物大分子的沉降特性和結構，而不是專門收集某一特定組分。因此它使用了特殊的轉子和檢測手段，以便連續地監視物質在一個離心場中的沉降過程。
分析性超速離心的工作原理：
分析性超速離心機主要由一個橢圓形的轉子，一套真空系統和一套光學系統所組成。該轉子通過一個柔性的軸聯接一個高速的驅動裝置，這軸可使轉於在旋轉時形成自己的軸。轉子在一個冷凍的真空腔中旋轉，其容納二個小室：分析室和配衡室有上下二個平面的石英窗，離心機中裝有的光學系統可保證在整個離心期間都能觀察小室中正在沉降的物質，可以通過對紫外光的吸收(如對蛋白質和DNA)或折射率的不同對沉降物進行監視，後一方法的原理是：當光線通過一個具有不同密度區的透明液時，在這些區帶的界面上產生光的折射。在分析室中物質沉降時重粒子和輕粒子之間形成的界面就象一個折射的透鏡，結果在檢測系統的照相底板上產生一“峰”。由於沉降不斷進行，界面向前推進，故“峰”也在移動，從峰移動的速度可以得到物質沉降速度的指標.
