成骨多肽

骨生長肽（osteogenic growth peptide,OG P）是由14個胺基酸殘基組成的多肽，是一種對骨髓損傷有系統性應答的促進因子，以微摩爾級濃度存在於哺乳動物的血清中。

基本介紹

• 中文名：成骨多肽
• 外文名：osteogenic growth peptide,OG P
• 【別 名】：骨生長肽,OGP（10-14）
• 組成：14個胺基酸殘基組成的多肽

定 義

骨生長肽（osteogenic growth peptide,OG P）是由14個胺基酸殘基組成的多肽，是一種對骨髓損傷有系統性應答的促進因子，以微摩爾級濃度存在於哺乳動物的血清中。OGP最早由再生骨髓中分離出，其C端的OGP（10～14）五肽是保持全部OGP樣活性的最小胺基酸序列。OGP能刺激成骨細胞的活性，促進成骨細胞和成纖維細胞的生長，還能促進由基質微環境刺激所引起的繼發性造血反應。OGP及OGP（10～ 14）對於骨質疏鬆症和血液系統病的研究和治療具有重要價值。 構效關係

骨生長肽的發現及結構

近年來已有不少有關OGP, OGP（10～14)及其類似物的活性、合成方法及構效關係的研究報導。 早期的實驗研究結果表明，骨髓損傷或去骨髓後，骨髓再生過程的早期有一個骨形成階段，在骨髓中出現一個成骨相，形成暫時性骨小梁，隨後骨小梁被破骨細胞吸收，骨髓得以再生。這些結果提示再生骨髓組織中含有可促進成骨細胞有絲分裂和骨形成的調節因子。

1992年，Bab等首次從再生骨髓的培養液中分離純化得到一種含14個胺基酸殘基的具有成骨作用的生長因子，命名為OGP，其一級結構為Ala-Leu-Lys-Arg-Gln-Gly-Arg-Thr- Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly,該序列與組蛋白H4的C端（90～ 103）序列完全一致，即OGP的生物合成是通過改變組蛋白 H4 mRNA的翻譯起始點完成的。OGP的相對分子質量為 1523，從人血清中提取的OGP的胺基酸序列同大鼠和小鼠的OGP胺基酸序列完全相同，並且與大多數動物具有同源性，顯示出OGP的結構在進化上保守性，也提示不同哺乳動物體內的OGP可能具有相同的生物功能。這一發現極具生物學和醫學價值。OGP也可以從體外培養的NIH 3T3成纖維細胞系,MC3T3 El成骨細胞系和ROS17/2.8骨肉瘤細胞中分離得到。 通過研究OGP的結構與生物功能的關係，發現OGP由其前體H4（85～103）經細胞內蛋白酶裂解而成，OGP的N 端能與OGP結合蛋白(OGP binding protein,OGPBP)結合形成複合物OGP-OGPBP。α2-巨球蛋白（α2-macroglobulin, α2M）是其中的一種主要OGPBP。α2M最初以“天然型”存在於血清中，與蛋白酶共價結合後轉變成“激活型”。OGP可與這兩種形態的α2M非共價型地結合。天然型α2M-OGP複合物幫助 OGP向靶細胞傳輸，同時有效地保持血液中OGP的貯存量，防止其被降解和消除；激活型α2M-OGP複合物則傾向於通過加熱或競爭反應將OGP游離出，成為有免疫反應活性的 irOGP（immunoreactive OGP）。游離irOGP的主要形式是OGP (10～14)，即Tyr10-Gly11-Phe12-Gly 13-Gly14。自然狀態下的人血清和大鼠成骨細胞培養液中也含有由OGP水解產生的 OGP(10～14），它是OGP的活性片段。進一步對OGP (10～14)的5個胺基酸進行結構修飾研究發現，Tyr的酚羥基、Phe的芳香環是其中必需的活性基團，OGP（10～14）的完整序列是保持全長OGP活性的最小片段。內源性OGP的分泌量受反饋機制調控，給予低劑量外源性OGP時，血清中內源性OGP水平升高，但增大劑量使OGP水平達峰值後再增加反而抑制內源性OGP水平。調控機制尚待研究，可能與複合物OGP-OGPBP與OGP受體的作用方式有關。

骨生長肽的功能

2.1　促進骨形成

給正常大鼠皮下注射OGP，能增加骨小梁、類骨質厚度和礦化積沉率，提示OGP可促進正常礦化骨的形成。對骨折兔給予OGP治療後，血清中的鹼性磷酸酶和骨鈣素水平升高，表明促進了骨形成。體外實驗也證實OGP可刺激成骨細胞和成纖維細胞的增生，促進骨基質礦化，並能增強鹼性磷酸酶的活性。在培養大鼠的MC3T3 El成骨細胞液和NIH 313成纖維細胞液中加入OGP可促進這些細胞的增殖；在大鼠骨髓細胞培養液中加入OGP，能明顯刺激骨髓基質鈣化；在大鼠成骨細胞培養液中加入OGP，鹼性磷酸酶和骨鈣濃度顯著升高。OGP（10～14）具有等同的活性。

2.2　促進造血功能

OGP可調節骨髓基質細胞增殖，對整個造血系統有促進作用。給正常小鼠注射OGP後，骨髓細胞數增多約40%，白細胞數升高50%以上，而且不會改變這些細胞之間原來的比例。OGP也可通過上調成骨細胞和其他骨髓細胞系產生的造血刺激因子，而為繼發性造血提供好的基質微環境。 OGP（10～14）同樣可作用於人骨髓幹細胞、外周血和臍血，使粒細胞集落刺激因子（GCSF），粒細胞一巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）活性增強，其白細胞數和外周血幹細胞數增加。研究結果顯示，OGP和OGP（10～14）能刺激各種血細胞數量平衡增加，不會破壞造血幹細胞增生所需的微環境。

OGP的製備

3.1　細胞培養液提取分離法

OGP最早由再生骨髓培養液中分離純化而得。將大鼠體外再生骨髓細胞培養液超濾，熱變性後的均相濾質經體積排斥色譜、陽離子交換色譜和反相高效液相色譜分離，得到純度為99%的OGP。OGP也可從哺乳動物的血清中提取分離得到。

3.2　固相合成法

可選擇適當的固相載體、α-氨基保護基和側鏈保護基，適當的偶聯劑對OGP進行固相合成。固相載體可選擇4-甲基二苯甲胺樹脂、羥甲基樹脂。α-氨基保護基可選用芴甲氧羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基（Boc），苄氧羰基（Z）。當使用Fmoc 系統進行固相合成時，可選用下列被保護的胺基酸殘基： Fmoo-Leu，Fmoc-Tbr（But），Fmoc-Gly，Fmoc-Lys（Boc），Fmoc-Gln （Trt）Fmoc-Tyr（But）和Fmoc-Arg（Pbf）；使用Boc系統進行固相合成時，可選用下列被保護的胺基酸殘基：Boc-Leu，Boc-Thr （Bzl），Boc-Gly，Boc-Lys（Clz），Boc-Gln，Boc-Tyr（Brz），Boc-Arg （Tos）；使用Z系統進行固相合成時的情況與Boc系統類似。偶聯劑可選用：二環己基碳二亞胺(DCC)、二異丙基碳二亞胺 (DIC)，同時可用羥基苯驕三氮唑（HOBt）或7-氮雜羥基苯並三唑（HOAt）作為活化劑。首先將α-氨基被保護的Gly的C 端連線到固相載體上，按照給定的胺基酸序列，由C端逐個向N端延伸。合成完成後，用三氟醋酸或氟化氫將OGP肽從樹脂上切割下來並去除各保護基，經提取得到粗品，再經色譜析脫鹽，高效液相色譜法進一步純化，得到純度99%以上的OGP。

OGP（10～14）的製備

4.1　固相合成法

OGP（10～14）的固相合成法與OGP的C端五肽的固相合成方法類似。將OGP(10～14）中C端的Gly的羧基與高分子固相載體以共價鍵相連，α-氨基的保護基亦可選用 Fmoc，Boc或Z，由C端至N端按給定順序經脫保護、縮合、再脫保護、縮合的反覆過程得到P-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-Resin(P 為保護基Fmoc，Boc，或Z，Resin為樹脂載體)，再經割除樹脂和脫去保護基步驟，得到OGP(10～14)。

4.2　液相合成法

選用DCC或有機磷化合物DEPBT作為縮合劑，在二甲基甲酞胺（DMF）或（DCM）溶劑中首先合成Boc-Tyr（Brz）－ Gly-Phe-OMe與Boc-Gly-Gly-OMe，繼採用3+2的肽合成路線，將二肽片段經TFA脫除Boc保護基、三肽片段經皂化後縮合得到Boc-Tyr（BrL)-Gly-Phe-Gly-OMe,再經皂化和脫氨基保護基，得到OGP（10～14）。

4.3　酶促合成法

由於酶促肽合成法具有立體專一性好，反應條件溫和，環境污染小等優點，這一方法也被套用到OGP（10-14）的合成中。可採用3+2或2+3的合成路線，在有機溶劑中進行全酶法合成。在2+3的路線中，分別以α-胰凝乳蛋白酶作為催化劑，合成二肽片段Z-Tyr-Gly-OH和三肽片段Z-Phe-Gly- Gly-OEt或Boc-Phe-Gly-Gly-OEt,再將三肽片段脫除氨基保護基後，在嗜熱菌蛋白酶催化下，與二肽片段進行縮合，得到Z- Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OEt,經皂化和脫氨基保護基得到OGP(10 ～14）。而在3+2合成路線中，用α-胰凝乳蛋白酶催化縮合得到Z-Tyr-Gly-Me,再在木瓜蛋白酶催化下縮合得到三肽片段Z-Tyr-Gly-Phe-OMe,經皂化後在α-胰凝乳蛋白酶催化下，與二肽片段H-Gly-Gly-OEt縮合得到Z-Tyr-Phe-Gly-Gly-OEt，再經皂化和脫氨基保護基得到OGP（10～14）。2+3合成路線的收率高於3+2的合成路線。

OGP（10～14）的衍生物及其活性

構效關係研究結果表明：OGP（10～14）作為保持 OGP活性的最小片段，Tyr（10），Phe（12），Gly（13）和Gly（14）是保持OGP活性所必需的胺基酸殘基，Tyr（10）和Phe（12）的邊鏈是必不可少的藥效基團，且C末端的羧基相對於Tyr和 Phe的位置對OGP(10～14)的生物活性也起重要作用。進一步的實驗研究結果表明，OGP（10～14）N末端的氨基脫去得到daOGP（10～14）仍能在體外試驗中保持70%的OGP活性，在體內試驗中保持100%的OGP活性。當OGP(10～14)中有任意一根肽鍵被CH2NH、CONMe或CH2CH2取代時，得到的衍生物仍能保持OGP（10～14）的部分活性。OGP（10～14）的線性反式反轉異構體H-Gly-Gly-D-Phe-Gly-D-Tyr-OH具有（OGP (10～14）的活性。另一方面，OGP（10～14）末端對末端環化得到的環五肽C(Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly)也保持了OGP(10～14) 的活性，其反式異構體C（D-Tyr-Gly-D-Phe-Gly-Gly），反轉異構體C(Gly-Gly-Phe-Gly-Tyr)，反式反轉異構體C(Gly-Gly-D-Phe- Gly-D-Tyr)都具有與OGP (10～14)類似的活性。以上OGP （10～14）的環肽類似物中，C（Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly），以Gly-Gly- Phe-Gly-Tyr), C (Gly-Gly-D-Phe-Gly-D-Tyr)的活性已超過OGP (10~14），以反式反轉環肽C (Gly-Gly-D-Phe-Gly-D-Tyr）的活性為最好。此外，以Pro代替Gly11,所得到的線性的[Pro11]OGP（10～14）和環狀的C[Pro11]OGP（10～1 4）均具有與 OGP(10～14）類似的活性。這一系列研究結果提示，肽的骨架並非其識別分子靶標並與之相互作用的關鍵因素，它只是藥效基團在與生物學相關的布局下的帶有特定空間間距的載體。這些OGP（10～14）的活性類似物為新藥的研究與開發提供了有益的思路。

OGP及OGP（10～14）的臨床套用前景

6.1　用於骨質疏鬆症的治療

骨質疏鬆會引起全身骨量減少、骨鈣流失、骨脆性增加、骨質變得疏鬆多孔，使骨折發生率增加。骨質疏鬆症的治療通常採用促進骨形成和抑制骨流失兩種方法，OGP屬於前者，後者有雌激素、降鈣素等。雌二醇能與雌激素受體高度親和，表現雌激素受體激動劑活性，抑制破骨細胞活性，減少骨鈣流失。但對乳腺和子宮內膜有刺激作用，長期使用有引發乳腺癌和子宮內膜癌的危險。降鈣素是調節鈣代謝的內源性激素，能直接作用於破骨細胞上的降鈣素受體，抑制破骨細胞對骨的吸收，缺點是容易引起甲狀旁腺功能亢進和產生抗體。OGP及OGP（10～14）是內源性的成骨生長因子，直接作用於成骨細胞。陳統一等利用大鼠骨質疏鬆模型，對鮭魚降鈣素和合成OGP進行了實驗比較，結果表明，OGP具有很強的促成骨細胞和成纖維細胞活性的作用，能促進骨量增加，防止骨流失；而鮭魚降鈣素是通過抑制破骨細胞活性而達到提高骨量的效果，OGP的作用效果優於鮭魚降鈣素。且OGP以自分泌和旁分泌的方式行使其調節功能，合成OGP避免了長期使用可能造成的免疫原性，因此不良反應較少，在骨質疏鬆症的預防和治療方面前景廣闊。

6.2　用於放療化療患者造血機能的恢復

當患者接受放療化療後，血細胞數量全面下降。通常採用粒細胞集落刺激因子（G-CSF），粒細胞-巨嗜細胞集落刺激因子（GM-CSF）等生血因子進行治療。這些因子主要作用於造血幹細胞，使其定向分化為不同的白細胞，從而使白細胞和中性粒細胞的數量增加，不能平衡地引起多細胞系的反應，需結合其他因子共同使用才能有效地全面恢復患者的造血機能。由於許多腫瘤細胞也含有GCSF和GM-CSF受體，因而有導致殘存癌細胞增生，引起腫瘤復發的危險。 OGP及OGP(10～14）作為內源性肽，對機體的整個造血功能都有明顯的促進作用，且不刺激上皮細胞的增生，也不增加細胞對基質的黏附，是一種理想的生血因子。

6.3　用於骨髓移植患者機體恢復

骨髓移植是各種血液腫瘤、再生障礙性貧血、重度地中海貧血症及一些先天性免疫缺乏或者代謝疾病的根本治療方法。減少骨髓移植的治療時間，就能減少患者被感染的機會，促進健康的早日恢復。OGP對各類造血細胞都有刺激作用，通過改善骨髓造血微環境，上調成骨細胞和其他骨髓細胞系產生的造血刺激因子，非選擇性地刺激白細胞、紅細胞和血小板的增殖，並增加骨髓細胞數。Gurevitch等的實驗研究結果表明，在輻射引起重度骨髓抑制並進行骨髓移植前給予小鼠OGP，移植後30d的生存率比對照組高89%，白細胞數升高超過50%，骨髓細胞數增多40%，而細胞分類比例不變，提示OGP一方面可在短時間內促進移植的骨髓生長，另一方面可以通過促進造血幹細胞的定向分化來全面促進血細胞水平的恢復。從作用機制來看，OGP及OGP（10～14) 對骨髓移植患者的恢復治療比G－CSF和GM-CSF效果更全面，不良反應較小，對骨髓供體的骨髓抽取量也較少。

6.4　其他方面的套用

OGP及OGP（10～14）還可用於體弱貧血者、體能過度消耗者的體能恢復，可用於骨折延遲癒合或不癒合患者治療時間的縮短和治療效果的改善。另外，OGP在整形外科手術和骨科手術方面也可套用。 OGP作為一種有絲分裂原，對成骨細胞和骨髓造血幹細胞的促分裂增生作用，為臨床上骨質疏鬆症和血液系統疾病的治療提供了新的途徑，對OGP的最小活性片段OGP（10～ 14）的研究，為骨生長肽作為藥物開發和保健品研發提供了非常好的基礎。目前市場推廣和使用比較廣泛的腎骨元素3+、骨動能等產品都是非常具有價值的骨關節修復類產品，其特點是能夠在修復骨細胞的同時增加人體的循環系統功能和免疫機能，徹底解決骨關節疾病的根源問題，同時可以使股周圍組織及骨連線得以修復，具有極大的推廣價值。