《恆溫擴增高通量高靈敏度螢光成像檢測microRNA的研究》是依託河北大學，由成永強擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：恆溫擴增高通量高靈敏度螢光成像檢測microRNA的研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：成永強
- 依託單位：河北大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
開發簡便、高通量、高靈敏度microRNA檢測新技術對深入研究microRNA的作用機制和疾病的早期診斷及治療等具有重要意義。本項目通過在樣品microRNA兩端連線上通用連線子序列，套用切口酶引導的反轉錄恆溫擴增反應，產生含有microRNA互補序列的cDNA文庫；在溶液中加入通用模板，使所有cDNA成環，形成環形鎖式探針文庫。然後，採用兩種方法進行成像分析：一是直接以通用模板作引物，引發恆溫滾環擴增反應，產生序列重複的長鏈DNA，套用多色量子點標記探針進行螢光成像檢測，可同時檢測多種microRNA；二是轉移環形探針到固定了多種microRNA相應捕獲探針的微陣列晶片上，進行滾環擴增反應，採用一種通用螢光標記探針進行螢光成像檢測，構建microRNA的表達圖譜。所建立的兩種恆溫擴增、螢光成像分析方法可為microRNA的深入功能研究提供簡便、高通量、高靈敏度的分析技術平台。
結題摘要
利用恆溫滾環擴增（RCA）反應結合陽離子共軛聚合物（CCP）螢光共振能量轉移（FRET）檢測技術，建立了靈敏、均相檢測microRNA (miRNA)的新方法, 方法可為miRNA的均相RCA檢測和原位成像分析以及臨床診斷提供一種新策略。結合RCA和特異連線酶鏈式反應（LCR）反應雙擴增，套用普通螢光染料檢測，實現了單核苷酸多態性（SNP）的高靈敏度和特異性分析，方法結合RCA和LCR兩種擴增技術的優點，擴展了RCA和LCR的套用，為核酸高靈敏度檢測和分子診斷分析提供了新技術。基於LCR高效擴增能力和CCP的獨特的光捕獲特性及信號放大作用，系統研究了均相LCR結合CCP生物感測檢測核酸及miRNA的新方法。發展建立了均相LCR結合核酸外切酶I和外切酶III輔助CCP螢光共振能量轉移高靈敏度檢測SNP的新方法，方法成本低且不需要昂貴的儀器，擴大了LCR的套用，為均相檢測LCR以及遺傳分析和分子診斷提供了平台。建立了均相LCR結合lambda核酸外切酶輔助CCP生物感測高靈敏度檢測miRNA的新方法, 方法可檢測低至0.1fM的miRNA分子，套用於人肺組織全RNA樣品中let-7a的檢測，結果滿意。方法進一步簡化了均相LCR探針設計，拓展了LCR方法的套用。利用雙鏈特異核酸酶（DSN），結合分子信標探針，研究發展了恆溫擴增，簡便、均相高靈敏度檢測miRNA的新方法，方法靈敏度高，特異性好，對於多重miRNA成像分析具有重要意義。套用電化學氧化法新製備了一種水溶性和生物兼容性好的碳納米粒子（CNP），利用其優良的螢光猝滅能力和表面對單鏈DNA和雙鏈DNA/miRNA雜交體的親和力不同，發展建立了一種恆溫檢測miRNA的新方法。同時，利用核酸酶對單鏈DNA和雙鏈DNA/miRNA雜合體有不同的降解產物，碳納米粒子對產物吸附性能存在顯著差異的特點，實現了核糖核酸酶 H（RNase H）和脫氧核糖核酸酶 I (DNase I)的酶活性的檢測。方法簡便快速，費用低，靈敏度高。
