《嵌合甲基化轉移酶在體外靶向沉寂HIV-1前病毒的研究》是依託復旦大學，由曲喜英擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：嵌合甲基化轉移酶在體外靶向沉寂HIV-1前病毒的研究
- 依託單位：復旦大學
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：曲喜英
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
HIV潛伏感染細胞中整合的前病毒其可逆性的基因沉默是愛滋病人停藥後病毒載量又會反彈到治療前水平的重要原因。倘若通過甲基化的表觀修飾使HIV潛伏細胞中前病毒發生不可逆性的基因沉默，則有可能同人類內源性逆轉錄病毒一樣導致病毒長期失活。為此，本申請課題擬設計並構建多個靶向HIV前病毒的核酸酶（ZFP或Cas9）與DNA或組蛋白甲基化轉移酶的嵌合表達載體，分別在細胞上篩選出具有較好的靶向性以及活性的嵌合體；將篩出的嵌合表達載體轉染HIV感染及潛伏感染細胞，檢測分析HIV前病毒基因表達水平，探討嵌合甲基化轉移酶對整合HIV前病毒表達是否有抑制作用？檢測分析HIV前病毒基因組及其核小體上組蛋白甲基化的水平及類型，探討新建立的甲基化模式是否可通過每次細胞分裂遺傳下去，闡明嵌合甲基化轉移酶使HIV前病毒基因沉默的分子機制；本研究將有助於了解HIV潛伏調控的表觀遺傳學機制，也為愛滋病治癒提出了一個新的思路。
結題摘要
HIV潛伏感染細胞中整合的前病毒其可逆性的基因沉默是愛滋病人停藥後病毒載量又會反彈到治療前水平的重要原因。倘若通過甲基化的表觀修飾使HIV潛伏細胞中前病毒發生不可逆性的基因沉默，則有可能同人類內源性逆轉錄病毒一樣導致病毒長期失活。本課題設計並構建多個靶向HIV前病毒的核酸酶與DNA或組蛋白甲基化轉移酶的嵌合表達載體，分別在細胞上篩選出具有較好的靶向性以及活性的嵌合體；將篩出的嵌合表達載體轉染HIV感染及潛伏感染細胞，檢測分析HIV前病毒基因表達水平，探討嵌合甲基化轉移酶對整合HIV前病毒表達是否有抑制作用？檢測分析HIV前病毒基因組及其核小體上組蛋白甲基化的水平及類型，探討新建立的甲基化模式是否可通過每次細胞分裂遺傳下去，闡明嵌合甲基化轉移酶使HIV前病毒基因沉默的分子機制。 本課題已圓滿完成上述研究內容，發表SCI論文2篇（考核指標SCI文章1篇），專利申請1項（考核指標1項），畢業研究生1人（考核指標1人），已取得如下重要結果： 我們以HIV-1的轉錄調控區LTR上的保守區為靶點，利用基因編輯技術，構建並篩選出以鋅指蛋白為DNA結合域的嵌合甲基轉移酶ZF-Dnmt1以及以dCas9/sgRNA為DNA結合域的嵌合甲基轉移酶dCas9-Dnmt3a。在HEK-293T和TZM-bl細胞上進行靶點篩選並檢測了嵌合蛋白的表達，我們將具有較好靶向性以及活性的嵌合體轉染HIV假病毒感染的細胞模型及潛伏感染的細胞模型，結果表明，這些嵌合甲基轉移酶能顯著抑制前病毒的表達，其作用機制與靶向前病毒LTR轉錄起始位點兩側的CpG島甲基化水平增高有關。同時，這種靶向抑制分別能在感染細胞模型和潛伏感染細胞模型上持續15天和40天以上，說明嵌合甲基轉移酶造成的前病毒表達抑制能夠在細胞代際之間遺傳。最後，在Jurkat T細胞中的細胞毒性評估證明了這些嵌合甲基轉移酶具有較好的安全性。這些結果支持了DNA甲基化與HIV沉默的相關性，證明了宿主細胞與HIV“和平共處”策略的可能性，為治癒愛滋病提供了一種新思路。
