小菜蛾Spatzle和Dorsal基因對抗菌肽表達調控的機理研究

《小菜蛾Spatzle和Dorsal基因對抗菌肽表達調控的機理研究》是依託華南農業大學，由金豐良擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：小菜蛾Spatzle和Dorsal基因對抗菌肽表達調控的機理研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：金豐良
• 依託單位：華南農業大學

項目摘要

昆蟲抗菌肽是體內一種具有廣譜抗菌作用的小分子多肽，其表達受Toll/NF-кB信號途徑的調控。本項目擬以小菜蛾為實驗材料，運用同源克隆結合RACE技術克隆小菜蛾Toll信號通路中的Spatzle(Spz)和Dorsal(Dor)基因，運用RNAi抑制Spz和Dor基因的表達，阻斷或減弱小菜蛾抗菌肽產生的信號傳導，使小菜蛾更易感染病菌而死亡，以期為通過調控害蟲免疫系統的開啟來控制害蟲奠定基礎；運用定量RT-PCR、Northern印跡等方法檢測Spz及Dor阻斷前後抗菌肽基因的表達譜，闡明Spz和Dor在小菜蛾免疫應答信號傳導中的功能；採用SSH文庫篩選免疫的健康小菜蛾和RNAi抑制小菜蛾蟲體的抗菌肽cDNA序列，以期獲得小菜蛾體內新的抗菌肽基因。該項目運用了靶標特異性強的RNAi技術，避免了環境污染，為小菜蛾的綜合防治提供了一種新的手段，並為新的抗菌肽基因的篩選開闢新的思路。

結題摘要

1、 為了更好的挖掘小菜蛾體內的免疫相關基因，本項目測定了實驗室敏感型小菜蛾和田間小菜蛾的轉錄組，綜合篩選到725條與免疫相關的Unigene序列；其中Spatzle序列3條，Dorsal序列2條。 在此序列的基礎上，利用RT-PCR和RACE克隆了小菜蛾Spatzle（KF960052）和Dorsal（KF960046）基因的cDNA全長和相關抗菌肽基因的cDNA全長，模式識別蛋白基因的cDNA全長，為研究Spatzle和Dorsal基因對抗菌肽的調控提供了靶標基因。 2、 為了更好探討小菜蛾Spatzle(PxSpa)和Dorsal(PxDor)的結構和功能。在原核細胞中表達了Spatzle和Dorsal，並製備了多克隆抗血清。為了研究Spatzle的功能，在果蠅S2細胞中表達了Spatzle的功能區C-108個胺基酸（PxSpa-C108）和PxDor，利用His-taq一步純化了重組的PxSpa-C108 和PxDor。利用製備的PxSpa-C108蛋白和抗PxSpa血清分別注射小菜蛾，結果表明在注射PxSpa-C108蛋白的血淋巴中的殺菌活性明顯高於注射抗PxSpa血清的殺菌活性；同時注射PxSpa-C108蛋白的血淋巴中的細菌的存活率明顯低於注射抗PxSpa血清的血淋巴中的細菌存活率；結果表明PxSpa在啟動抗菌肽表達過程中起著重要作用；而注射PxDor蛋白並沒有增強血淋巴的殺菌活性。 3、 利用RNAi阻斷了PxSpa 的表達，螢光定量PRC檢測表明，PxSpa 表達沉默後，PxDor基因的表達明顯下降，抗菌肽基因Cecropin1，Cecropin2，Cecropin3，Gloverin，Defensin和Lysozyme1的表達明顯降低，而且，RNAi阻斷了PxSpa的表達後的血淋巴中的細菌M15存活率明顯升高。RNAi阻斷了PxDor的表達，也同樣降低了以上抗菌肽的表達，結果表明PxSpa和PxDor在小菜蛾抗菌肽表達過程中起調控作用。進一步研究表明，PxSpa基因的沉默，提高了玫煙色棒束孢對小菜蛾的致病能力。 4、 通過以上研究，挖掘了小菜蛾免疫相關基因，明確了PxSpa和PxDor在小菜蛾抗菌肽表達中起著重要功能；發表文章4篇，其中SCI文章一篇；投稿文章（SCI）3篇；申請專利6個。