對鱗翅目昆蟲高毒力的Btcry1Ah基因及其表達產物:專利背景,發明內容,專利目的

《對鱗翅目昆蟲高毒力的Bt cry1Ah基因及其表達產物》是中國農業科學院植物保護研究所於2004年12月1日申請的專利，該專利的申請號為2004100099189，公布號為CN1614022，授權公布日為2005年5月11日，發明人是張傑、宋福平、黃大昉、何康來、韓嵐嵐。

《對鱗翅目昆蟲高毒力的Bt cry1Ah基因及其表達產物》為“對鱗翅目昆蟲高毒力的Bt crylAh基因”，屬於生物防治技術領域。《對鱗翅目昆蟲高毒力的Bt cry1Ah基因及其表達產物》涉及對鱗翅目害蟲具有抗性的Bt crylAh基因及其一種部分序列和由該基因及其部分序列所編碼的蛋白質及多肽序列。進一步，《對鱗翅目昆蟲高毒力的Bt cry1Ah基因及其表達產物》還涉及這些基因及其部分序列和由它們所編碼的蛋白質及多肽在鱗翅目害蟲生物防治中的套用。

2016年12月7日，《對鱗翅目昆蟲高毒力的Bt cry1Ah基因及其表達產物》獲得第十八屆中國專利優秀獎。

基本介紹

中文名：對鱗翅目昆蟲高毒力的Bt cry1Ah基因及其表達產物
公布號：CN1614022
授權日：2005年5月11日
申請號：2004100099189
申請日：2004年12月1日
申請人：中國農業科學院植物保護研究所
地址：北京市海淀區圓明圓西路2號
發明人：張傑、宋福平、黃大昉、何康來、韓嵐嵐
Int.Cl.：C12N15/31、C07K14/32、C12N15/63、C12N15/82
代理機構：北京海虹嘉誠智慧財產權代理有限公司
代理人：張濤
類別：發明專利

專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,有益效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,

專利背景

蘇雲金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis，簡稱Bt）是一種革藍氏陽性產芽孢土壤細菌，廣泛分布於土壤、蟲屍、植物根圍、糧倉塵埃等區域。眾所周知，它在芽孢形成期能產生蛋白性質的晶體，對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目、食毛目、同翅目等昆蟲，甚至線蟲等動物均具有毒殺活性，而對人類、高等動物、植物等非靶標生物安全無害，已被廣泛地套用於農業、林業、衛生害蟲的防治。

1981年，Schnepf和Whiteley等克隆了第一個Bt殺蟲蛋白基因cry1Aa，於1985年完成了核苷酸序列分析，該基因對鱗翅目害蟲具有活性。隨後，對鞘翅目、雙翅目等害蟲有活性的菌株和基因相繼被發現和分離克隆（Krieg，A.etal，J.Appli.Entomology，1983，96：500-508；Ward，E.S.，andDJ.Ellar.1986.J.Mol.Biol.191：1-11.Herrnstadt，C.etal，Gene，1987，57（1）：37-46；Payne，J.，K.E.Narva，andJ.Fu.December1996.U.S.Patent5,589,382.）。隨著生物技術的突飛猛進，Bt轉基因工程菌和抗蟲植物的商業化取得巨大成功，各國均加大投入，以期獲得新的高毒力、新活性的Bt菌株和基因。截止到2004年10月底，全球共發現和公布了323種Bt殺蟲蛋白基因（可參見http：//www.biols.susx.ac.uk/home/NeilCrickmore/Bt/list.html）。

1996年全世界第一例轉基因抗蟲植物在美國獲準套用，它所使用的基因主要部分就是來自Btcry1Ac。在接下來的幾年裡，轉cry1Ab基因的抗蟲玉米、轉cry3Aa基因的抗蟲土豆等GMO相繼問世，截止到2003年底，在美國抗蟲棉種植面積占總棉花種植的73％，玉米占到40％（CliveJames，InternationalServicefortheAcquisitionofAgri-BiotechApplication，preview，No.30，2003）。在中國，自1998年開始正式推廣含有cry1Ac/1Ab基因的抗蟲棉以來，累計種植已達9千萬畝，僅2004年種植面積就高達3700萬畝。在中國獲準商業化的還有轉基因抗蟲楊樹，它所使用的基因與抗蟲棉幾乎相同。與此同時，中國國內相關研究單位正在進行環境釋放的抗蟲轉基因植物有水稻（cry1Ac/1Ab或者cry1Ab）、玉米（cry1Ac/Ab）。但無論是已商品化還是處於研究評價階段的抗蟲工程植物所用的基因都具有種類單一的缺點，因此如果大面積推廣這些抗蟲作物將存在害蟲避難所減少、抗藥性上升過快的風險。解決這一問題的有效方法是尋找新的高毒力基因或基因組合作為新的替代和補充。美國孟山都公司的第二代抗蟲棉就採用了對棉鈴蟲高毒的cry2Ab基因進行組合（BruceE.Tabashniketal.，APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY，Aug.2002，p.3790-3794；Nicholas，D.etal，TransgenicPlantandInsectPestsBiocontrol，JohnWiley&SonsPress，USA，1997，1-18）。

因此，篩選分離克隆新的、高毒力的Bt殺蟲蛋白基因，將能豐富殺蟲基因資源，為轉基因工程菌和抗蟲植物的研製提供新的基因來源，提高Bt轉基因產品的抗蟲效果，並有望降低害蟲對Bt毒蛋白的抗性風險，避免新的生態災難降臨，具有重要的經濟、社會和生態效益。

發明內容

專利目的

針對2004年12月前世界上防治鱗翅目害蟲所使用的Bt製劑以及轉基因產品基因品種單一、害蟲易於產生抗性、殺蟲譜較窄和毒力較低等不足，《對鱗翅目昆蟲高毒力的Bt cry1Ah基因及其表達產物》從中國國內Bt菌株中分離克隆了新的基因cry1Ah，該基因表達產物對多種鱗翅目害蟲毒力強於已知的Cry蛋白。這種新的基因可以套用於轉化微生物和植物，使之表現對相關害蟲的高毒性，並克服、延緩害蟲對工程菌和轉基因植物抗藥性的產生。

技術方案

1.出發菌株BtBT8菌株中cry基因的鑑定

採用Kuo（KuoandChak，Appl.Environ.Micro.1996，62：80-86）和宋福平的PCR-RFLP鑑定體系對中國國內Bt分離株（宋福平、張傑、黃大昉等，《中國農業科學》，1998，第31卷，第3期，第13-18頁）進行cry基因分析，發現該菌株中存在cry1Aa、cry1Bacry2Aa、cry2Ab等已知基因，同時發現了一種尚不能定名的新基因cry1X。

2.BT8菌株中cry1Ah基因的克隆

採用快速克隆方法對該菌株中的新cry基因進行分離克隆。

按照Narva（Narva，K.E.etal，EP0462721A2，1991，8）等的方法從BtBT8菌株（該菌株來自於中國農業科學院植物保護研究所生物技術實驗室，可向公眾提供）中提取質粒DNA，用Sau3AI酶部分消化質粒DNA，從凝膠中回收4-7kbDNA片段，純化後與經BamHI消化、鹼性磷酸酶處理的pUCP18載體進行連線（SchweizerHP，Gene，1991Jan 2；97（1）：109-21.），轉化大腸桿菌JM107（購自美國NEBiolab公司，32TozerRoadBeverly，MA01915-5599，USA）後，用cry1基因通用引物K5un2/K3un2對能在抗生素Amp上正常生長的陽性轉化子進行PCR擴增鑑定，篩選含有Btcry基因的陽性轉化子。引物分別為：

正向引物（Forwardprimer）：TCCTGCAGTTGACTTCAAATAGG；

反向引物（Reverseprimer）：CAGTCGACTCATCCGATAAACACGCCAC’

通過附圖6所示的程式及條件對pHT59進行亞克隆。對篩選得到的重組質粒pHT59，進行DNA序列分析，結果表明該質粒含有cry1Ah基因全長DNA片段。該基因全序列如SEQIDNO1所示，共含有3549bp；由其編碼的蛋白質的胺基酸序列如SEQIDNO2所示，該蛋白質共由1182個胺基酸組成，分子量為134千道爾頓，等電點為pI4.985。Btδ--內毒素基因國際命名委員會把該基因命名為cry1Ah1。

3.穿梭表達載體的構建

根據cry1Ah1全長基因3549bp的核苷酸序列設計一對引物，並在引物5’端加上限制性酶位點，用於基因與表達載體的連線，引物序列如下：

正向引物：5’C GGGATCCATGAAAAACAGTATCAA3’

BamHI

反向引物：5’ACGC GTCGACCTATTCCTCCATAAGGAG3’

SalI

3549bp的PCR產物經BamHI、SalI消化後克隆於含有Bt複製子的Bt-E.coli穿梭質粒pSXY422（7.3kb）。該質粒由pUC18改造而成，加入了Bt質粒的複製子、Btcry基因營養期表達啟動子Pcry3Aa和來自pET21b質粒的多克隆位點，成為穿梭表達載體（該質粒來自於中國農業科學院植物保護研究所生物技術實驗室，可向公眾提供）。所獲得的重組表達載體質粒命名為pSXY422-1Ah。採用Lereclus等轉化方法（Lereclus，D.etal，FEMS MicrobiologyLetters，1989，60：211-217），利用pSXY422-1Ah轉化Bt無晶體突變株HD73--（該菌株來自於中國農業科學院植物保護研究所生物技術實驗室，可向公眾提供）。對能在紅黴素抗性平板上生長出的陽性轉化子進行多種分子檢測，證明轉化成功。將該轉化子命名為工程菌Biot1Ah。該菌能在Bt無晶體突變株HD73-穩定遺傳，穩定性大於90％。

4.工程菌的培養和觀察

採用GT培養基（配方為：液體GT：每升中加入10ml0.8％CaCl₂，10mlG-Tris鹽（0.025％FeSO₄.7H₂O，0.05％CuSO₄.5H₂O，0.05％ZnSO₄.7H₂O，0.5％MnSO₄.H₂O，2.0％MgSO₄），10ml20％（NH₄）₂SO₄，10ml5％K₂HPO₄，10ml20％葡萄糖，50ml1MTris-HCl，pH7.5，1.5g酵母提取物，pH7.4；固體GT：在液體GT中加入1.3％瓊脂）、1/2LB培養基（配方為：液體LB：Tryptone1％，酵母提取物0.5％，NaCl1％，pH7.0；固體LB：在液體培養基中加1.3％瓊脂）分別培養Biot1Ah工程菌，用電子掃描顯微鏡和光學顯微鏡觀察結果。結果顯示在Biot1Ah中存在雙錐體形晶體，證明該基因正常表達。

5.cry1Ah1基因5’-端活性區確定和表達研究

根據其它cry1A基因活性區大於1.8kb的情況，設計引物B.2001bp部分基因引物：

正向引物：5’CG GGATCCATGAAAAACAGTATCAA3’

BamHI

反向引物：5’ACGC GTCGACTGATCAATATGATAATCCG3’

SalI

把2001bp的PCR產物經BamHI、SalI消化後克隆於E.coli表達載體pET21（購自於美國NovagenInc，601ScienceDriveMadison，Wi53711），把所獲得的重組表達載體質粒命名為pET1Ah-2。利用pET1Ah-2轉化大腸桿菌BL21（DE3）（Dubendorff，J.W.andStudier，F.W.1991，J.Mol.Biol.219，45-59.），經過IPTG誘導表達了75kD的多肽。

6.殺蟲生物活性測定

利用的鱗翅目害蟲包括：小菜蛾（Plutellaxylostella）為二齡幼蟲；棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）、亞洲玉米螟（Ostrinafurnacalis）、水稻二化螟（Chilosupperssalis）為一齡幼蟲。上述測試昆蟲為標準實驗室飼養種群。

還有大豆食心蟲（Leguminivoraglycinivorella）：在自然種植的大豆田中誘捕成蟲，室內產卵孵化的1～2幼蟲。

以不同濃度的Bt毒蛋白為樣品進行單獨測試和組合測試，時間4-7天。實驗數據按標準進行相關處理。

有益效果

《對鱗翅目昆蟲高毒力的Bt cry1Ah基因及其表達產物》分離克隆的Btcry1Ah基因和其一種部分序列及其它們的基因表達產物能夠對鱗翅目害蟲產生強毒力，這種毒力強於2004年12月前國際上發現的同類自然菌株的基因。通過cry1Ah基因與cry1Ab、cry1Ba、cry2Ab等基因表達產物組合，可擴大對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目害蟲的殺蟲譜。通過套用於轉化微生物和植物，使它們表現出對相關害蟲的毒性，克服或延緩昆蟲對工程菌和轉基因植物抗藥性的產生。

附圖說明

圖1為BT8cry1型基因的PCR擴增產物及RFLP。其中M代表pUCDNA混合Marker（1116，883，692，501，489，404，331，242，190 147，111，110bps），1為Kun3引物PCR擴增產物1.4kb，2為1/PstIandEcoRI酶切，3為4/PstIandXbaI酶切，4為Kun2引物擴增產物1.6kb。

圖2為含有目的基因的重組質粒pHT59PCR-RFLP鑑定。其中M代表pUCDNA混合Marker，1為Kun2引物擴增產物/PstI+XbaI，2為Kun3引物擴增產物/PstI+EcoRI。

圖3為pHT59單酶切分析。其中1、2、3、4、5、6和M分別代表：pHT59/EcoRI、HindIII、KpnI、PstI、SacI、XbaI和λDNA/Ecol30Imarker（19.1，7.7，6.2，4.2，3.4，2.7，1.9，1.5，0.9，0.4kb）。

圖4為pHT59質粒雙酶切分析。其中1、2、3、4、5、6、7和M分別代表pHT59/EcoRIandXbaI、pHT59/EcoRIandKpnI、pHT59/EcoRIandHindIII、pHT59/EcoRIandPstI、pHT59/EcoRIandSacI、pHT59/SacI andPstI、pHT59質粒和λDNA/EcoO130Imarker。

圖5亞克隆質粒pHT59-32、pHT59-15、pHT59-22的酶切分析。其中1、2代表pHT59-15/HindIII，3、4代表pHT59-32/HindIII，5、6代表pHT59-22/HindIII，M為λDNA/EcoO130Imarker。

圖6為cry1Ah基因/pHT59的亞克隆流程圖。

圖7為cry1Ah全長基因穿梭表達載體pSXY422-1Ah酶切分析。其中1、2為cry1Ah全長基因PCR擴增產物，3為穿梭載體pSXY422/BamHIandSalI，4為pSXY422-1Ah/BamHIandSalI，M代表λDNA/EcoO130Imarker。

圖8為cry1Ah基因2.0kb片段PCR擴增檢測。其中1、2為E.coli表達載體pET21b/BamHIandSalI，3、4代表cry1Ah基因5’端2.0kb片段PCR擴增產物，M代表λDNA/EcoO130Imarker。

圖9為含有cry1Ah基因2.0kb片段重組質粒pET1Ah-2酶切分析。其中1、M分別代表pET1Ah-2/BamHIandSalI和λDNA/EcoO130Imarker。

圖10為cry1Ah基因2.0kb片段在E.coli中表達產物SDS-PAGE檢測。其中1、2代表表達細胞形成的包含體蛋白組分，3為可溶性蛋白組分，4為陰性對照菌（BL21：pET21b），M代表分子量marker（212，116，97，66，40kD）。

圖11為不同培養時間BT8中各種cry基因的表達。其中12、18、24、30、36分別代表細菌培養時間（小時），M代表分子量marker（212，116，97，66，40kD）。

圖12為不同培養時間工程菌Biot1Ah中cry1Ah基因的表達。其中18、24、30、36、48分別代表細菌培養時間（小時），M代表分子量marke （212，116，97，66，40kD）。

圖13為Cry1Ah蛋白晶體（工程菌Biot1Ah）的掃描電鏡結果。

圖14為cry1Ah全長基因與其它cry1類基因核苷酸序列同源進化樹。

圖15為cry1Ah2.0kb基因與其它cry1類基因相同長度核苷酸序列同源進化樹。

圖16為Cry1Ah蛋白與其它Cry1類蛋白全長胺基酸序列同源進化樹。

圖17為Cry1Ah蛋白與其它Cry1類蛋白N-末端667個胺基酸序列同源進化比較。

技術領域

《對鱗翅目昆蟲高毒力的Bt cry1Ah基因及其表達產物》屬於生物防治技術領域。進一步，《對鱗翅目昆蟲高毒力的Bt cry1Ah基因及其表達產物》涉及對鱗翅目害蟲具有高毒力的Bt cry1Ah基因及其一種部分核苷酸序列和由該基因及其部分序列所編碼的蛋白質及多肽。

權利要求

1.一種對昆蟲具有毒性的BtcrylAh基因，其特徵是該基因具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列。

2.一種對昆蟲具有毒性的蛋白質，其特徵是該蛋白質是由權利要求1的基因所編碼，且具有SEQIDNO2所示的胺基酸序列。

3.一種權利要求1的BtcrylAh基因的部分序列，其特徵是該部分序列具有SEQIDNO3所示的核苷酸序列。

4.一種對昆蟲具有毒性的多肽，其特徵是該多肽是由權利要求3的部分序列所編碼，且具有SEQIDNO4所示的胺基酸序列。

5.一種轉化微生物或植物的方法，其特徵是該方法套用權利要求1的crylAh基因。

6.權利要求5的方法在轉化微生物或植物使之表現出對昆蟲的毒性並克服或延緩昆蟲抗藥性產生中的套用。

7.一種轉化微生物或植物的方法，其特徵是該方法套用權利要求3的crylAh基因的部分序列。

8.權利要求7的方法在轉化微生物或植物使之表現出對昆蟲的毒性並克服或延緩昆蟲抗藥性產生中的套用。

實施方式

實施例1、BT8菌株的基因型鑑定

按照Narva（Narva，K.E.etal，EP0462721A2，1991）的方法從Bt菌株BT8中提取質粒DNA。以B-8-G菌株質粒DNA為模板，用cry1的3’端引物（K5un2和K3un2）、5’端引物（K5un3和K3un3）進行PCR擴增，PCR循環參數分別為94℃1分鐘，54℃1分鐘，72℃3分鐘，32個循環，72℃延伸10分鐘。分別獲得了cry1型基因3’端的1.6kb、5’端的1.4kb兩種片段PCR產物，該DNA片段經過氯仿抽提純化後進行限制性內切酶消化反應，37℃1-2小時，瓊脂糖凝膠電泳分析酶切片段的多態性（附圖1）。分析結果（見表1）表明BT8菌株含有cry1Aa，cry1Ba，cry2Aa，cry2Ab和一個未知的新的cry1基因（cry2基因結果從略）。

實施例2、BT8菌株新基因的克隆

經鑑定BT8菌株中含有一個未知的新的cry1基因，採用以下方法進行分離克隆。BT8質粒經Sau3AI部分酶切，回收4-7kb片段，與BamHI酶切的載體pUCP19連線轉化JM107，經PCR擴增和RFLP分析（附圖2）獲得含有BT8菌株新cry1型基因的陽性轉化子ETG59，把重組質粒命名為pHT59。

依據已有的cry1類基因的酶切圖譜分析，選擇EcoRI、HindIII、KpnI、PstI、SacI、XbaI等分別對pTG59進行單一酶切分析（附圖3），結果表明pHT59上克隆的外源片段為6.9kb。經過EcoRI和XbaI、EcoRI和KpnI、EcoRI和HindIII、EcoRI和PstI、EcoRI和SacI、SacI和PstI雙酶切分析（附圖4），構建了該基因大片段的物理圖譜。根據多種酶切分析結果選擇HindIII酶切片段進行亞克隆，pHT59經HindIII完全消化為6.7kb（2.2kb和pUCP194.5kb）、3.2kb、1.5kb三個片段，分別將3.2kb、1.5kb與HindIII酶切的pBlueScriptSK連線，6.7kb片段自連，轉化大腸桿菌，經質粒酶切分析篩選獲得了三個亞克隆，所含重組質粒命名為pHT59-32、pHT59-15、pHT59-22（附圖5）。附圖6為此亞克隆流程圖。

對三個亞克隆進行序列測定，再與其它cry1基因進行同源序列比較，表明該基因為全長新基因。該基因編碼區3549bps（SEQIDNO1），編碼1182個胺基酸的蛋白（SEQIDNO 2），分子量為134千道爾頓，等電點為pH4.985。該基因由Btδ內毒素基因國際命名委員會命名為cry1Ah1。

實施例3、cru1Ah全長基因穿梭載體的構建

為了便於克隆和表達，根據cry1Ah1基因編碼區全長核苷酸序列，設計了一對分別含有BamHI和SalI酶切位點的特異性引物。PCR擴增條件為94℃1分鐘，54℃1分鐘，72℃3分鐘，32個循環，72℃延伸10分鐘，採用高保真性能的pfu聚合酶進行擴增。獲得了3.5kb cry1Ah全長片段，如附圖7中A的第1、2樣品所示。經BamHI和SalI雙酶切完全反應後，進行電泳，從凝膠中回收該片段，與經同樣的酶切處理的Bt-E.coli穿梭表達載體pSXY422進行連線反應，12℃12小時；取連線產物2微克轉化E.coli受體菌JM110，以Amp抗性平板篩選陽性重組質粒。將所獲得的陽性重組質粒分別接種於液體LB試管中，37℃230轉每分培養12小時，以常用的鹼解法提取質粒，分別進行BamHI和SalI的單、雙酶切反應，通過凝膠電泳鑑別得到含有cry1Ah基因全長片段3.5kb的重組表達克隆pSXY422-1Ah，附圖7中B為雙酶切檢測結果，其中3號為pSXY422空載體，4號為pSXY422-1Ah。

實施例4、Bt工程菌Biot1Ah的構建

將來自JM110的重組表達克隆pSXY422-1Ah用電激方法轉化E.coli甲基化突變株SCS110，電激條件為：2500V，400歐，25微克F，100微克感受態細胞，1微克質粒DNA。37℃溫浴1小時，100轉每分；從SCS110中提取去甲基化的pSXY422-1Ah質粒。

製備Bt無晶體突變株HD-73-感受態，用電激轉化方法將去甲基化的pSXY422-1Ah質粒導入其中。電激條件：2200V，1000歐，25微克F，100微克感受態細胞，1微克質粒DNA。30℃溫浴2小時，100轉每分；以25微克/毫升Ery（紅黴素）平板篩選陽性轉化子。經過提取質粒、酶切分析、PCR擴增等分子檢測，獲得了含有pSXY422-1Ah表達質粒的Bt陽性轉化子，將該轉化子命名為工程菌Biot1A。

實施例5、Bt工程菌Biot1Ah的培養、觀察和檢測

活化工程菌Biot1Ah（30℃，12小時）；1％接種於1LGT培養基中，加入紅黴素，終濃度為25微克/毫升，30℃，230轉每分，振盪培養20～48小時；在培養期間，每隔6小時取1毫升培養液，進行蛋白表達的時空研究；同時培養出發菌株BT8，作為參照。取少量培養物進行光學顯微鏡檢測，觀察細胞裂解、芽孢的釋放和晶體的形成。待40％的營養體細胞裂解時，停止培養，離心收集菌體，加入100毫升1MNaCl/10mMTris·Cl（pH7.5）溶液洗滌2次，無菌水洗滌3次，以除去發酵次生代謝物和鹽分，4℃，6,000轉每分，離心10分鐘（這些培養物可以-20℃保存備用）。取上述胞晶混合物進行掃描電鏡的觀察和記錄。結果（附圖13）顯示，cry1Ah基因在Bt無晶體突變株HD-73-中能正常表達，形成cry1基因所特有的雙錐體型晶體。

取上述胞晶混合物20毫克，懸浮於100微克水中，加入25微克0.5NNaOH，25℃作用5分鐘；加入65微克3×樣品緩衝液，100℃煮沸5分鐘，離心去除沉澱；分別進行SDS-PAGE電泳檢測，結果如附圖11和12所示。圖11表明：在出發菌株BT8中，130kD左右的蛋白自18小時能夠被檢測到，至36小時均能穩定存在和積累，晶體數量相應較多。而在工程菌Biot1Ah中，自24小時以後可以檢測到134千道爾頓的Cry1Ah蛋白（圖12），並隨著培養時間延長而不斷積累，能形成相當數量的穩定的雙錐體狀晶體（圖13），與天然菌株相同。連續繼代和稀釋塗板測定，結果表明工程菌遺傳穩定性在98％以上。

實施例6、cry1Ah基因活性區2.0kb片段克隆、表達與檢測

克隆：根據cryAh1基因從5’-段其始密碼子ATG至2001bp處核苷酸序列，設計了一對分別含有BamHI和SalI酶切位點的特異性引物。PCR擴增條件為94℃1分鐘，54℃1分鐘，72℃2分鐘，30個循環，72℃延伸10分鐘，反套用酶為pfu聚合酶。擴增獲得2.0kbcry1Ah活性區片段（見附圖8中第3、4樣品），經BamHI和SalI雙酶切完全反應後，進行電泳，從凝膠中回收該片段，與經同樣的酶切處理的E.coli表達載體pET21b進行連線反應，18℃4小時，取連線產物2微克轉化E.coli受體菌BL21，以Amp抗性平板篩選陽性重組質粒。將所獲得的陽性重組質粒接種於LB試管中37℃230轉每分培養12小時，提取質粒，分別進行BamHI和SalI的單、雙酶切反應，得到含有cry1Ah基因2.0kb片段的陽性克隆pET1Ah2，附圖9為雙酶切檢測結果。

誘導表達：活化陽性克隆BL21（pET1Ah2）（37℃，12小時）；1％接種於1LLB培養基中，37℃，230轉每分，振盪培養至OD₆₀₀為0.5～0.8，（約2小時）；加入誘導物IPTG，終濃度為0.7mM，150轉每分，20℃低溫誘導18小時；離心收集菌體，加入50毫升10mMTris·Cl（pH8.0）懸浮；超音波破碎細胞壁（B.BraunULabsonic，230V，T間隔＝0.5sec），處理10分鐘，反應控制在0℃；4℃，12,000轉每分，離心10分鐘；收集上清及沉澱，分別進行SDS-PAGE電泳檢測。

SDS-PAGE電泳：對上述蛋白樣品的處理：取100微克上清液，或包涵體沉澱懸浮於100微克10mMTris·Cl緩衝液中，分別加入50微克3x樣品緩衝液（25微克上樣緩衝液+75微克β-巰基乙醇），100℃煮沸5分鐘，離心除去沉澱；將樣品依次加入濃縮膠中，4℃下電泳；完成染色、脫色和凝膠掃描和數據記錄分析。在Cry1Ah活性區2.0kb表達產物為75kD，與預測結果一致。cry1Ah基因2001kb的部分核苷酸序列如SEQIDNO3，其編碼的多肽即Cry1Ah的一半共667個胺基酸的序列如SEQIDNO4所示。