對數殘留定律

微生物受熱死亡主要是由於微生物細胞內蛋白質受熱凝固、變性失活所致。在一定溫度下，微生物的受熱死亡反應可描述為一級化學反應，遵循一級化學反應動力學，即微生物的熱死亡速率與任一瞬時殘存的活菌數成正比，稱之為對數殘留定律。

基本介紹

• 中文名：對數殘留定律
• 外文名：logarithmic remainder theory
• 對象：微生物
• 過程：微生物受熱死亡
• 死亡原因：細胞內蛋白質受熱凝固、變性失活
• 反應級別：一級化學反應

簡介

微生物在高溫下時，其體內的一些蛋白質、酶等可發生凝固變性，從而導致微生物無法生存而死亡。微生物受熱而喪失活力，但其物理性質不變。在一定溫度下，微生物的受熱死亡遵照分子反應速率理論，微生物的死亡速率與任一瞬時殘存的活菌數成正比，即在滅菌過程中，活菌數逐漸減少，其減少量隨殘留活菌數的減少而遞減，這就是對數殘留定律，其數學表達式為：

-dN/dt=kN （1）

式中：N一殘存的活菌數，個；t一滅菌時間，min；k一滅菌速率常數，min^-1，也稱比死亡速率常數，此常數的大小與微生物的種類及加熱溫度有關；dN/dt一活菌數瞬時變化速率，即死亡速率。

上式通過積分可得：

-kt=ln(N_t/N₀) （2）

式中：N₀一開始滅菌(t=0)時原有的活菌數，個；N_t一經時間t後殘存的活菌數，個。

式(2)是計算滅菌的基本公式。從式中可知，滅菌時間取決於污染程度(N₀)、滅菌程度(殘留菌數N_t)和滅菌速率常數(k)。k值是以存活率N_t/N₀的對數對時間t作圖後，得到的直線斜率的絕對值，它是判斷微生物受熱死亡難易程度的基本依據。各種微生物在同樣的溫度下k值是不同的，k值愈小，則此微生物愈耐熱，細菌芽孢的k值比營養體小得多，即細菌芽孢耐熱性比營養體大。同一微生物在不同的滅菌溫度下，k值是不同的，滅菌溫度越低，k值越小，溫度越高，k值越大。圖1所示為某些細菌在121℃時的k值。

圖1

原始污染和滅菌度

滅菌開始時培養基中所污染的微生物主要是細菌的細胞和芽孢，二者之和即是N₀，實際設計滅菌工藝時常取N₀=10⁵/mL。

式(1)和式(1)可圖示於圖2。從圖2可見，在滅菌過程中活菌數呈指數減少，ln(N_t/N₀)與滅菌時間呈直線關係，其斜率為-k。當滅菌時間無限長時才能達到所謂無菌狀態，即N_t=0，這是不可能實現的，故滅菌後培養液中還殘存一定量的活菌數。通常生產中取培養基的滅菌要求即滅菌度為N_t=10^-3個/罐，即每處理1000罐中只允許1罐因為滅菌不徹底而發生染菌，或者說因培養基滅菌不徹底而造成染菌的幾率是1/1 000，此數已滿足生產要求。

圖2

微生物對k值的影響

圖2所示的活菌數與滅菌時問的關係只存在於只有一種生理形式的純培養細胞的滅菌結果，是在理想化滅菌條件下進行的。k值不僅與菌種有關，菌種不同其k值不同，且與菌體細胞的生理狀態有關，如芽孢的耐熱性遠遠超過其營養細胞，通常生長期細胞的k值在121℃時為10～10¹⁰ min^-1，而芽孢的k值在121℃時約為1 min^-1。因此，芽孢熱滅菌反應可能並不完全符合對數殘留定律。Richards(1968)用一系列圖描繪了實際生產中套用該理論產生的偏差。圖3表示的是熱處理時間對芽孢存活的作用結果。活芽孢數偏離上述指數式減少是由於滅菌過程初期的溫度和水分誘導孢子萌發。圖3—A示早期階段，激活的孢子數明顯超過殺滅的孢子數，因此，在觀察到指數式降低之前活菌數反而增加；圖3—B示激活的孢子數與死亡的孢子數平衡；圖3—C示激活的孢子數比死亡的要少。

圖3

不同種類的芽孢其耐熱性不同，熱死亡反應速率常數k也不同(圖4)。在發酵生產實際設計滅菌工藝時，既不能取營養細胞的k值進行計算，因為營養細胞的k值很大，根據對數殘留定律計算得到的滅菌時間就很短，不能殺死芽孢；也不能取用最耐熱的芽孢的K值，如果這樣，計算出的滅菌時間就會很長，且最耐熱的芽孢在微生物發酵培養基中出現的幾率相當小。

因此，實際設計計算時往往取發酵培養基中出現幾率較高的枯草芽孢桿菌的芽孢的k值進行計算。

圖4

溫度對k值的影響

對於一級化學反應，由於反應速率常數隨溫度升高而增大，所以其反應速率也將隨溫度升高而增大。微生物熱死亡反應速率常數即是微生物比死亡速率(k)，因此，k只有在特定條件下才是真正不變的。

滅菌效果和營養成分的保持

培養基中營養成分的破壞也符合對數殘留定律和一級反應定律。例如：維生素B₁的活化能E=26千卡/克分子，葡萄糖的活化能是24千卡/克分子，比細菌芽孢的活化能要小得多，所以在高溫下微生物的死亡速度要比有機物的破壞來得快。人們利用這一點，採用高溫短時間滅菌的辦法來減少營養物的破壞。雖然溫度增加，破壞也增加，但因受熱時間大為縮短，總的破壞量因之減少。有人做過試驗，把有維生素B₂的培養基在118℃時滅菌，保溫15分鐘以及在128℃時保溫1.5分鐘，即同樣達到滅菌要求。試驗結果：培養基中維生素B₂的保留量在128℃、1.5分鐘時為95%；而在118℃、15分鐘時僅為90%。從圖5中可以更清楚地說明這個問題，表中的溫度和時間關係是以同樣達到殺死細菌芽孢為基準。

培養基中營養成分破壞到一定程度，減少了微生物的營養，就會直接影響發酵，使發酵產率降低甚至抑制發酵，所以在確定滅菌溫度和時間時，首先要測定培養基中微生物數(細菌數)，定出合理的滅菌溫度和時間，並保持培養基的清潔和新鮮。培養基中原有含菌數，菌的種類往往與原料來源及氣候環境條件有關，所以要根據毛主席教導的“對於具體的事物作具體的分析”定出合理的操作規程，才能避免不必要的損失。

圖5

有人試驗採用藥物(甲醛、雙氧水等)和濕熱聯合滅菌的方法，可進一步降低滅菌溫度保/持營養成分。如在發酵檸檬酸的培養基中預先添加250毫克/升的甲醛溶液，再在100℃下保溫20分鐘濕熱滅菌。發酵結果表明，與在120℃下保溫15分鐘不添加任何抗菌藥物的滅菌方法比較，其產酸率顯著提高。這是因為添加抗茵藥物後可使菌的反應速度常數乃值增大而變得不耐熱的緣故。