家蠶BmMLs和BmToll9回響LPS引發免疫和自噬的研究

《家蠶BmMLs和BmToll9回響LPS引發免疫和自噬的研究》是依託華南農業大學，由楊婉瑩擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：家蠶BmMLs和BmToll9回響LPS引發免疫和自噬的研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：楊婉瑩
• 依託單位：華南農業大學

項目摘要

脂多糖（LPS）可以通過TOLL途徑誘發哺乳動物的免疫反應和細胞自噬，但不能誘導雙翅目昆蟲果蠅抗菌肽的表達。最近研究發現LPS可以誘導鱗翅目昆蟲家蠶抗菌肽的表達，說明家蠶對LPS的免疫反應通路與果蠅的TOLL和IMD信號通路不同。我們前期研究發現，LPS可以誘導家蠶受體蛋白BmMLs和抗菌肽Glov1高表達，結構功能分析也提示BmToll9可能參與了LPS的識別。因此我們推測：家蠶的TOLL途徑存在著一個旁路分支，LPS能夠不依賴於細胞介素Sp?etzle，直接與BmMLs結合後被BmToll9識別，從而啟動TOLL信號途徑誘導抗菌肽的表達和細胞自噬。本項目擬通過LPS誘導家蠶後細胞自噬的檢測、BmMLs和BmToll9對LPS的結合試驗及BmToll9的RNAi等方法，研究BmMLs和BmToll9在LPS誘導家蠶免疫反應通路中的作用，為闡明鱗翅目昆蟲先天免疫信號通路提供科學依據。

結題摘要

昆蟲對病原物的防禦方式為先天免疫(innate immune)，果蠅（Drosophila）中，PGRP-SA/SD識別Lys-PGN後活化Späetzle，進而與Toll受體結合，啟動Toll信號途徑。脊椎動物也通過TLR（Toll-like receptor）識別病原物，但其可以直接識別不同的PAMPs。研究表明脂多糖（LPS）通過TLR4引起哺乳動物強烈的免疫反應和自噬，我們在家蠶（Bombyx mori）的研究中發現LPS能引起家蠶抗菌肽的表達，預示著家蠶中有受體可以識別LPS並誘發先天免疫，為了研究鱗翅目昆蟲經LPS誘導後其先天免疫情況，及跨膜受體Toll在進化上的功能，我們以家蠶為模式生物，進行了以下內容的研究：（1）通過抑菌實驗檢測LPS引發活體家蠶的免疫反應的情況。（2）原核表達家蠶ML蛋白BmEsr16、BmML-1，Elisa檢測其是否能和LPS體外結合。（3）克隆BmToll9至PIEX-4-GFP載體，轉染家蠶細胞，研究BmToll9是否對LPS有回響。（4）構建基因表達譜資料庫，篩查回響LPS誘導的下游免疫相關基因。 本研究獲得了以下結果： 1. LPS等誘導家蠶6-18h後，提取家蠶血淋巴，檢測其抑菌活性，結果顯示LPS可以誘導家蠶抗菌肽的表達。 2.以哺乳動物中回響LPS的蛋白質為模板，對家蠶基因組資料庫進行BLAST搜尋，尋找到了三條ML蛋白質序列及BmToll9，結構域的分析,發現BmToll9與TLR4在結構及進化上是最接近的。 3. RT-PCR獲得BmEsr16、BmML-1基因，克隆表達獲得純化的BmEsr16和BmML-1重組蛋白，Elisa檢測發現BmEsr16和LPS可在體外直接結合。 4. 克隆BmToll9基因至PIEX-4-GFP載體上，轉化家蠶Bm12細胞，共聚焦顯微鏡觀察到BmToll9基因成功表達並跨膜。用LPS誘導轉染成功的細胞，qRT-PCR發現抗菌肽Moricin、Attacin1基因的轉錄表達活性上調，但是cecropinB6基因的轉錄活性沒有顯著變化，推測這兩類抗菌肽可能通過不同的免疫途經進行調控。 5. 為了進一步篩查尋找可能的通路基因，我們構建了差異基因表達譜資料庫，通過生物信息學分析找到了大量回響LPS的免疫相關因子，為進一步篩查LPS誘導的昆蟲免疫反應做數據儲備。