定向進化

定向進化是在試管中模擬達爾文進化過程,通過隨機突變和重組,人為製造大量的突變,按照特定的需要和目的給予選擇壓力,篩選出具有期望特徵的蛋白質,實現分子水平的模擬進化。這是目前改善蛋白質性能最有前途的方法。定向進化的發展拓寬了蛋白質工程的設計範圍，可在未知目標蛋白質結構信息和作用機制的情況下對蛋白質進行改造。

基本介紹

• 中文名：定向進化
• 外文名：Directed Evolution

發展史

定向進化發展初期，科學家主要將其用於篩選和控制(或影響)所需表型。20 世紀中期，蛋白質定向進化被引入實驗室用於再現和研究自然進化進程．近年，定向進化更多地被用來改善蛋白質性能，改進蛋白質藥物的穩定性、半衰期、免疫原性，開發酶的新底物利用以及改進或拓展新的代謝途徑等。最近的研究表明，蛋白質定向進化被成功地套用在代謝途徑的關鍵酶設計、新底物催化功能的開發、創造全新功能蛋白質以及篩選和鑑別預期功能蛋白質中，在代謝工程和合成生物學領域發揮了重要作用。

常用策略

蛋白質定向進化的本質是構建分子多樣性文庫以及從文庫中篩選到性狀有改進的突變體，根據文庫構建原理的不同，可分為隨機進化、改組技術、半理性進化和理性進化四種策略，其大致思路均為由某一靶基因或一族相關的家族基因起始，通過對編碼基因進行突變或重組，創建分子多樣性文庫；篩選文庫獲得能夠編碼改進性狀的基因，作為下一輪進化的模板；在短時間內完成自然界中需要成千上萬年的進化，從而獲得具有改進功能或全新功能的蛋白質。

隨機進化

蛋白質分離純化和結構解析的相關技術及軟體的快速發展，產生了海量的蛋白質結構信息．然而截至目前，蛋白質有效突變點的預測仍然十分困難，因而隨機進化(random evolution)仍是十分有效的蛋白質定向進化手段。

（1）易錯PCR技術

易錯PCR是一種簡便快速的在DNA序列中隨機製造突變的方法, 它是通過改變傳統PCR反應體系中的Mg2+濃度、dNTP的濃度比例、pH值或使用低保真度的Taq酶, 使鹼基在一定程度上隨機引入錯誤而創造序列多樣性文庫。這種方法對於建立任意核苷酸序列文庫或是在表達及篩選過程引入突變同樣有用。但是, 由於這種方法的關鍵在於控制合適的突變頻率, 所以較低的突變率(每代每序列有2 ～ 3 個鹼基置換或一個胺基酸替代)可以積累大部分的有益突變, 而較高的錯摻幾率將產生中性突變或有害突變。另外, 此法又是在分子內部進行的單一突變, 有害突變要比有益突變多。當一個突變體中有害突變占大多數時, 一般僅能形成無活性的蛋白分子;同樣, 如果突變位點過少, 則野生型序列在整個體系中占絕對優勢, 特徵表現不明顯, 也不利於後續的篩選和鑑定工作。

（2）定點突變和定點飽和突變技術

定點突變技術(Site-directed mutagenesis)一般用於對DNA分、子特定位點的突變, 所以需要預先知道野生型基因序列。早在1978年Michael Smith就運用寡核苷酸進行定點突變。定點突變的基本原理是首先合成一段含有突變鹼基的DNA引物, 然後這段合成的引物可以雜交到包含有目的基因的單鏈DNA上, 用DNA聚合酶將剩餘片段進行延伸, 得到的雙鏈分子轉入到宿主細胞並被克隆, 最後用特定的篩選方法將突變子篩選出來。定點突變技術有盒式誘變和多種基於PCR的突變方法, 最常見的有重疊PCR等方法。當靶位點胺基酸分別可被其它19種胺基酸代替而得到突變子的方法, 稱為定點飽和突變技術, 此方法是要著重尋求靶位點的最適胺基酸。定點突變和定點飽和突變技術的運用, 能極大地豐富突變體庫的多樣性。

（3）組合活性中心飽和突變試驗

組合活性中心飽和試驗(combinatorial active-site saturation test,CAST)的基本原理是:在酶的活性中心部位尋找一系列在空間位置上相互接近的胺基酸對作為突變位點, 選擇的胺基酸對必須是在側鏈基團取向上具有潛在的協同作用。因此, 突變後才可能獲得更具有潛力的突變體。這是單點突變不能做到的。如果選擇的胺基酸對應的位置是n, 則第2個胺基酸的選擇遵循以下的原則:如果第n個胺基酸在環上, 則另一個胺基酸選擇第n+1 位;若在β 摺疊上則選擇第n+2位, 若在310螺旋上, 則選擇第n+3位;若在α螺旋上, 則選擇第n+4位。對於CAST突變體庫容量的計算:每突變一對胺基酸要進行飽和隨機突變, 即這一對胺基酸要突變成20種胺基酸的任何一種。以NNK(N代表任何一種核苷酸, K代表是G或T)作為突變的鹼基形式, 則有322 =1 024種不同的組合, 而胺基酸則可突變成202 =400種不同的組合。因此, 要將每個庫的所有突變的覆蓋率達到95%, 則每個庫至少要挑3 000個克隆子。此外, 近年來還發展出了更多的、新穎的無性突變技術。例如, 三核苷酸突變(TriNex), 隨機插入-刪除突變(RID), 序列飽和突變(SeSaM)以及它的改進方法SeSaM-Tv+。這些方法都是為了能最大程度的增強突變體庫的多樣性, 豐富並延伸無性突變的方法手段。

改組技術

與隨機突變相比, 改組技術可以獲得更大程度的序列改變。根據不同的改組思想和不同的實驗條件, 有以下幾種策略可以選擇。

（1）同源改組

同源改組的典型代表是DNA Shuffling 與FamilyShuffling , 該技術利用酶或物理方法將一組帶有有益突變位點的基因(或天然存在的基因家族)隨機酶切成小片段, 然後進行無引物PCR 使之延長, 最後, 用基因兩側的引物合成全長基因。該技術可與隨機突變技術相結合, 迅速積累有益突變, 得到最佳突變組合的酶基因。其優點是操作簡單, 不必了解蛋白結構信息, 容易獲得良性突變。但缺點是只能對同源性較高的一組序列進行改組(70%以上)。在此思想基礎上, 還有許多改進的方法出現。例如利用隨機引物擴增全長基因, 擴增過程中還可引入突變的隨機引物體外重組法(random-priming invitro recombination ,RPR);利用單鏈DNA 作為模板的截斷模板重組延伸法(Recombined extension ontruncated templates , RETT);簡化實驗過程, 在同一管內即可完成改組的交錯延伸法(Stagger extensionprocess, StEP);利用臨時模板獲得高重組率的臨時模板隨機嵌合技術(Random chimeragenesis on transienttemplates ,RACHITT)等等。

（2）非同源改組

DNA Shuffling 對所操作基因的同源性要求較高, 而自然界中大多數同源序列的相似性達不到這么高的要求, 因此近幾年發展出許多基於非同源序列的改組技術。例如漸進切割雜和酶技術(incrementaltruncation for the creation of hybrid enzymes ,ITCHY), 通過用核酸外切酶對兩個親本基因分別進行消化, 產生一系列相差單鹼基的基因片斷, 再將兩組片斷化基因互相連線, 產生雜和基因文庫。該技術的優點是可以在無同源性或低同源性的兩個基因間產生重組, 缺點是重組一定是在兩個不同的父本之間產生, 並且子代中功能雜合子的比率很低。針對後一缺陷Sieber 等人提出非序列同源蛋白重組(sequence homology-independent protein recombination ,SHIPREC):通過瓊脂糖凝膠電泳回收單基因長度隨機片段, 保證了子代嵌合體長度的保守性, 使交叉點處的兩個胺基酸仍處於它們在親本蛋白質結構中的位置, 從而提高了文庫中功能雜合子的比例。前一缺陷通過SCRATCHY 技術得到解決,SCRATCHY 技術是在ITCHY 和DNA 改組技術基礎上發展起來的, 首先使用ITCHY 在兩個低同源性基因間建立廣泛的雜合基因文庫, 隨後該文庫被作為親本基因進行DNA 改組。其特點是不依賴基因序列的同源性而產生多個DNA 雜交位點。還有一些其他的非同源重組技術被建立, 如SCOPE (Structurebasedcombinatorial protein engineering)技術, 是一種半理性蛋白質工程技術, 可以在非同源基因間建立多位點雜交基因庫, 進而篩選雜和蛋白。SISDC(Sequence-independent site-directed chimeragenesis)技術, 可以使同源性較小或沒有同源性的一組蛋白基因在多個分散的位點發生重組。

（3）結構域改組

結構域改組不是以核苷酸為單位進行改組, 而是以具備相對完整性的基因片段作為改組單位。比較典型的例子是外顯子改組(Exon Shuffling)。在許多真核生物基因中, 一個外顯子編碼一個摺疊結構域, 因此可以利用內含子之間的重組使獨立的外顯子組裝成編碼新蛋白的基因。通過控制參與改組的外顯子範圍, 可產生不同特性的突變庫, 它可以引入更多的理性設計, 因此可套用於醫藥等某些特殊領域。對結構域改組的深入思考可以發現, 我們甚至可以將兩個功能相關的相鄰基因作為兩個大的結構域來進行改組, 以提高它們的協同效果。更進一步,可以對兩個細胞的全基因組進行改組, 達到改變代謝途徑的目的。

半理性進化

儘管隨機進化策略十分有效，但仍存在突變文庫大、陽性突變少、難以篩選等問題．半理性進化(semi-rational evolution)策略則藉助了生物信息學方法，在分析大量的蛋白質序列比對信息，二級結構數據，甚或是在同源建模得到目的蛋白三維空間構象的基礎上更有針對性地對蛋白質進行改造，不但提高了陽性突變率，而且大大縮小了突變文庫容量，更易於篩選．半理性進化的關鍵是通過計算機模擬獲得潛在的有益突變位點，再利用適當的飽和突變技術構建合適的突變文庫，此外，對於結構較為複雜的蛋白質，可將其分為不同的結構單元，並在其內部獨立進化，組合篩選最佳進化單元，得到完整蛋白質。

理性進化

理性進化策略主要是在計算機中(in silico)完成。通過計算機建模(computational modeling)預測蛋白質活性位點，考察某基因突變對目標蛋白穩定性、摺疊以及與底物結合的影響，從而對蛋白質進化進行設計指導和模擬篩選實驗，提高實驗的成功率。

在代謝工程中，雖然反應能壘對途徑的影響十分重要，但隨機進化和半理性進化策略均不能直接解決這一問題，從頭設計則能夠對這些因素加以考慮。從頭設計首先根據量子力學建模得到目的催化反應，額外考慮某個具有高能壘的反應，推測其過渡態，定位所需的催化側鏈並結合反應的最佳化過渡態．利用QM/MM 模型分析得到包含過渡態和涉及結合、催化的蛋白質功能團的理論蛋白質突變文庫，再利用Rosetta、ORBIT、PyMol 等軟體，在大量穩定的蛋白支架中搜尋能夠支持這些理想活性位點的蛋白質主鏈群，最終經過最佳化處理的基因序列即可進行實驗驗證。這種方法能夠在數百個潛在的模板酶側鏈中自動挑選合適的算法搜尋催化側鏈過渡態，並將其定位到合適位置，在一些研究中，單一蛋白質或最佳活性位點也可以進行手動選擇。從頭設計對於酶進化軌跡的分析有助於增強人們對蛋白質自然進化的理解，從實驗中獲得的反饋信息也可以更好地輔助完善理性設計。此外，利用計算機預測可以建立代謝途徑、分析代謝網路，從而使用工程學方法選出重要的酶加以進化，以達到整個途徑或網路的最佳化目的。

套用及前景

通過蛋白質的定向進化技術對蛋白進行分子改造, 極大地促進了酶工程、代謝工程以及醫藥等很多領域的發展, 對增強蛋白的穩定性及底物特異性、改變或增強蛋白質的活性等方面都取得了巨大的成果。

提高酶的催化活性

提高酶的催化活性是人們進行蛋白質改造最基本的願望之一。有許多報導都證明定向進化技術對於提高酶的催化活性起到了很好的效果。Shim等採用定點突變技術構建的突變體, 改變了位於酶活性中心的“蛋白-S-結合”口袋中Met-317, 並突變為Ala, 從而有利於底物範圍的擴大, 實際也證明其具有更高的催化磷酸二脂鍵的催化能力。澱粉蔗糖酶是一種催化蔗糖而得到的直鏈澱粉酶, 但是由於它直接催化蔗糖的活性較低, 使其的套用受到很大的限制。Potocki-Veronese等利用易錯PCR和DNAShuffling技術對其進行突變, 得到催化蔗糖活性提高60%的突變體Asn387Asp,從而擴大其套用範圍, 在實際生產中具有重要意義。

提高酶的穩定性

提高或改變蛋白特性另一個重要的方面就是提高熱穩定性, 因為這是在工業生產中運用酶催化反應而經常遇到的難題, 為了解決這一問題, 眾多科學家採用定向進化的方法改造蛋白, 期望提高其熱穩定性。Xiao等運用序列比對的結果為指導, 進行定點突變, 得到突變體的Tm值提高了6℃, 同時在不影響原有催化活性的基礎上, 在45℃時的半衰期比原酶提高了23倍之多。Miyazaki等為了適應生產化需要, 綜合了隨機突變、定點飽和突變和DNA shuffling的方法，將11 家族木聚糖酶進行改造以提高其熱穩定性。最終得到的突變體的半熱變性溫度從58℃提高到68℃, 最適溫度也從55℃升到了65℃, 同時在60℃的熱穩定性也明顯增強。

另外, 蛋白經常會在有機溶劑和水-有機溶劑混合溶液中失去原有的催化活性, 所以Moore等進行了隨機突變, 從枯草芽孢桿菌蛋白E的突變體庫中篩選出一株能夠在60%二甲基甲醯胺溶液中具有和在水溶液中相等的酶活;同樣, 通過隨機突變和基因重組將p-硝基苯酯酶在30%二甲基甲醯胺水溶液中的酶活提高了100倍以上。

改變酶的底物特異性

Manu等通過對纖維二糖磷酸化酶(CP)進行易錯PCR篩選, 得到的突變株作用底物從傳統的纖維二糖轉變成了乳糖, 隨即提高了乳糖磷酸化酶的活性。最終得到的突變體菌株的乳糖磷酸化酶的活性比原酶高出了10倍。改變對映異構體特異性。Schmidt等選用易錯PCR技術將來源於Pseudomonasfluorescens酯酶的對應選擇性野生型的E值從63提高至96, 同時活性也相應的增加了, 能夠達到2 min轉化50%的底物, 相當於1.25 U/mg的蛋白量。Arnold等運用易錯PCR和飽和誘變的方法, 成功地使一株傾向於D-型底物的乙內醯脲酶發生轉變, 使之變為傾向於L-型底物, 經過分析這種轉變只生髮了一個胺基酸的替換。與野生型的催化蛋白相比, 增加了L-甲硫氨酸的產量, 降低了不必要的產物積累。