季也蒙畢氏酵母菌菊糖酶合成和調控的研究

《季也蒙畢氏酵母菌菊糖酶合成和調控的研究》是依託中國海洋大學，由池振明擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：季也蒙畢氏酵母菌菊糖酶合成和調控的研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：池振明
• 依託單位：中國海洋大學

中文摘要

菊糖酶在食品、醫藥、發酵工業和生物燃料酒精生產等方面具有重要的用途，最近幾年我們在酵母菌菊糖酶生物合成、物理化學特性、基因克隆表達和潛在套用等方面取得了重要進展。但是該酶合成在季也蒙畢氏酵母中受到葡萄糖的嚴重阻遏作用。該申請項目就是要研究不同葡萄糖濃度對該酵母菊糖酶合成和菊糖酶基因表達的影響；研究Snf1和Mig1這兩種蛋白質在該酵母菊糖酶葡萄糖阻遏和葡萄糖解阻遏中的作用；研究該酵母基因敲除載體和高效表達載體的構建和套用。以便了解季也蒙畢氏酵母菊糖酶葡萄糖阻遏和解阻遏機理，以便將來在信號傳導水平上弄清葡萄糖與菊糖酶葡萄糖阻遏和葡萄糖解阻遏之間的相互關係，同時可以進一步提高季也蒙畢氏酵母的菊糖酶產量，使該酵母菊糖酶得到更廣泛的套用

結題摘要

首先研究了產菊粉酶酵母季也蒙畢氏酵母葡萄糖解阻遏與菊粉酶合成的關係，發現通過基因突變導致MIG1基因突變和Mig1蛋白質胺基酸發生變化，結果突變菌株的菊粉酶合成得到了葡萄糖解阻遏，菊粉酶產量明顯增加。本研究通過基因敲除法阻斷K. marxianus km菌株MIG1基因，獲得的敲除菌株 km-15菌株葡萄糖阻遏作用得到解除。與野生型菌株km的相比，敲除菌株km-15的乳糖酶、菊粉酶和β-葡萄糖苷酶的產量均有很大提高，同時編碼這些酶基因的表達量也有極大提高。說明K. marxianus km中的Mig1確實能阻遏某些基因的表達，對一些酶的合成具有調控作用。從扣囊復膜酵母A11菌株的基因組DNA中克隆到的MIG1基因全長1152 bp，編碼384個胺基酸的蛋白質，有高度保守的兩個鋅指結構，Mig1蛋白還有一個短的保守基序，可在葡萄糖阻遏中起重要作用。然後敲除扣囊復膜酵母A11菌株的MIG1基因，獲得的敲除菌株A11-c葡萄糖阻遏得到了解除。與菌株A11相比，敲除菌株A11-c澱粉酶、酸性蛋白酶和β-葡糖苷酶產量及其基因表達量有很大提高。說明扣囊復膜酵母中的Mig1確實能阻遏某些基因的轉錄，它對一些基因的表達和一些胞外酶的合成起調控作用。 敲除了高產油脂Y. lipolytica ACA-DC 50109的MIG1基因。敲除菌株細胞中的油滴數目明顯比野生型菌株的高，同時敲除菌株M25細胞油脂含量和脂類合成的有關基因表達量明顯比野生型菌株的高。但是與脂類降解有關的基因之一表達量下降，所以敲除菌株M25細胞的油脂合成得到了明顯提高。從K. marxianus km菌株基因組DNA中克隆了轉錄激活蛋白基因LAC9p1，該基因含有2700 bp，編碼含有900個胺基酸的蛋白質，該蛋白質除了具有除了具有高度保守的鋅指結構外，在乳糖存在情況下還能形成二聚體。然後敲除了K. marxianus km菌株中轉錄激活蛋白基因LAC9p1。當把獲得的敲除菌株 KM-HPT培養在乳糖、半乳糖和葡萄糖混合物以及半乳糖中，乳糖酶合成及其基因的表達量明顯下降。同時發現LAC9p1基因本身的表達也受到葡萄糖的阻遏，但受到乳糖和半乳糖的誘導。