《基於mER的人工質膜對幾種典型EEs雌激素效應作用機制研究》是依託中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院，由周煥英擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：基於mER的人工質膜對幾種典型EEs雌激素效應作用機制研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：周煥英
- 依託單位：中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
環境雌激素（EEs）可與體內受體結合影響人體生殖發育，導致癌症等多種疾病。目前EEs污染已對人類的生存和發展形成潛在威脅,但EEs對生物體的作用機制尚未十分清楚。基於膜受體(mER)的環境雌激素效應複雜多樣，本項目從mER與EEs作用之初對膜的影響入手，以雙酚A、雌二醇等典型EEs為代表，利用人工質膜探索mER與EEs的作用機制。通過天然電活性物質和連線蛋白篩選，以mER為功能元件，分子自組裝構建具有mER活性的人工質膜，SPR考察其效果及動力學參數；通過模擬活體細胞膜mER和EEs識別，結合膜片鉗及螢光標記技術，研究mER與EEs回響對膜的微觀重構作用；透射電鏡、MALDI-TOF及重組酵母培養實驗評價人工質膜的離體模擬效果。該模型的成功構建有助於進一步闡明mER介導的環境雌激素效應作用機制，並彌補現有環境污染物雌激素效應評價方法的不足，為逐步認識和預防EEs對人體的危害提供科學依據。
結題摘要
項目以典型環境雌激素雙酚A ，雌二醇為代表，以膜受體（mER）為功能元件，構建了具有生物活性的人工質膜模型，研究了雙酚A ，雌二醇對該體系的回響，通過重組人雌激素受體基因酵母菌雙雜交體系驗證了兩者的聯合作用，結合人工質膜實驗結果，對回響機制進行了初步的探索。實驗篩選了不同的電活性物質或連線蛋白，通過含有8個精氨酸長鏈多肽（R8）的預先修飾，實現了功能物質在人工質膜表面的自組裝，研究了修飾後體系對雌二醇的回響，為進一步研究不同修飾形式膜表面的結合奠定了基礎。實驗採用表面電漿共振感測器（SPR）考察了修飾前後的動力學參數，利用基質輔助雷射解吸飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）鑑定了偶聯效果，原子力顯微鏡（AFM）驗證了固定化效果，具體研究內容包括： 1.不同材料支撐雙層類脂膜的構建：實驗分別選擇膜片電極和新鮮瓊脂作為人工質膜的支撐材料，研究了膜的穩定性和不同成膜方法；成膜液成分以卵磷脂和膽固醇作為主要成分，根據不同的支撐材料，對濃度和配比進行了最佳化，構建了瓊脂支撐的穩定雙層類脂膜體系。 2.基於mER的自組裝人工脂膜體系研究：利用構建的穩定雙層類脂膜體系，構建了基於mER的自組裝雙層類脂膜，該體系對1×10-10mol/L 的17β-雌二醇可產生回響，濃度高於1×10-8 mol/L結合基本達到飽和。該體系對濃度為1×10-5 mol/L雙酚A可產生回響，1×10-10mol/L17β-雌二醇和1×10-5mol/L雙酚A同時作用時存在協同效應。重組人雌激素受體基因酵母菌雙雜交體系研究結果表明：低濃度的雌二醇與雙酚A混合作用的雌激素效應在低濃度呈現雌激素作用增強，在6.81×10-6mol/L後出現了抑制趨勢。該模型的建立有助於進一步分析mER介導的環境雌激素作用機制，是現有環境雌激素評價方法的有益補充。 3. 基於精氨酸修飾的自組裝人工脂膜體系研究：實驗篩選了不同的電活性物質或連線蛋白，構建了R8飾的自組裝人工脂膜體系。採用碳化二亞胺偶聯方法研究了R8與抗17β-雌二醇抗體的偶聯，MALDI-TOF-MS結果顯示偶聯比約為5:1,併合成了新型基質，對修飾位點進行了初步探索。SPR研究R8修飾偶聯前後抗體親和性能，AFM進一步測試了空白成膜液和自組裝後成膜液的表面形態。實驗採用競爭結合的方法驗證了構建人工類質膜的回響，對雌二醇的回響範圍分別為0.01-0
