基於BmCPV高分辨侵染態結構和分子互作的入侵機理研究

《基於BmCPV高分辨侵染態結構和分子互作的入侵機理研究》是依託華南農業大學，由孫京臣擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：基於BmCPV高分辨侵染態結構和分子互作的入侵機理研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：孫京臣
• 依託單位：華南農業大學

項目摘要

家蠶質型多角體病毒（BmCPV）是呼腸孤病毒科的代表種，研究並闡述其入侵機理具有重要的基礎科學意義和疫病防治方面的套用價值。課題組1996年來一直堅持從結構和分子兩個層面對BmCPV進行研究，並在國家基金基於冷凍電子斷層掃描的 BmCPV 入侵機制研究的資助下,獲得了BmCPV的高分辨原子模型和入侵過程的三維模型,還解析了多角體病毒的形成機制。本課題擬在前期的研究成果基礎上，結合冷凍電鏡單顆粒三維重構技術和雙分子螢光互補技術對BmCPV的侵染機理作更深入研究：包括BmCPV與宿主細胞蛋白的相互作用、BmCPV-受體複合物、VP4蛋白和活性轉錄態病毒粒子的三維重構等。研究內容立體覆蓋了病毒入侵期間的關鍵環節，其結果將進一步完善我們對呼腸孤病毒的入侵機理研究，並為今後開展基於CPV高分辨結構的入侵分子機理,開展病毒和細胞的互作研究和基於電鏡高分辨結構的病毒藥物設計研究奠定方法學基礎。

結題摘要

家蠶質多角體病毒(Bombyx mori Cytoplasmic Polyhedrosis Virus,BmCPV)屬呼腸孤病毒科(Reoviridae),質多角體病毒屬(Cypovirus),BmCPV-1是該屬代表種。CPV病毒分布極廣，其中輪狀病毒、雞傳染性法氏囊病毒、非洲馬瘟病毒和羊藍舌病毒等能使人畜致病。 套用overlap PCR等方法克隆yfpn-vp4融合基因，構建了pIZTV5-His-yfpn-vp4重組質粒，並轉染BmN細胞。套用RNAi等方法，研究了CPV病毒dsRNA與細胞RNAi系統的相互作用關係。套用直接計數冷凍電鏡和非對稱三維重構技術，確定了休眠期CPV(q-CPV)的dsRNA排列方式、原子解析度下q-CPV和轉錄態CPV(t-CPV)的TEC結構；並通過NTPase實驗和CPV六個近原子解析度下(2.9-3.1Å)結構變化比對，解析了病毒mRNA轉錄、加帽和運輸過程的整體協作機制。 首次發現BmCPV病毒SAM依賴的ATPase介導的dsRNA病毒轉錄和加帽信號通路，並將GTase亞單位重新命名為ATPase-GTase亞單位。當SAM和NTPs存在時，病毒TP蛋白MT-2和MT-1亞單位各結合1個SAM分子，病毒衣殼也向外擴張，結構發生改變，TP蛋白ATPase-GTase亞單位的ATPase活性位點結合併水解1個ATP分子，GTase活性位點結合1個GTP分子，從而激活病毒RNA轉錄和加帽。研究病毒dsRNA基因組片段與RNA聚合酶複合物(TEC)的原位結構，發現休眠期CPV(q-CPV)的10條dsRNA與10個TEC特異性結合，並以非對稱方式結合在CPV衣殼12個頂點中的10個特定頂點上；轉錄態t-CPV的TEC(RdRP與VP4蛋白)構象發生改變，形成模板RNA的進入通道，2個病毒衣殼蛋白(CSP)與RdRP、VP4相互作用，激活了CPV病毒轉錄，即CPV病毒外部衣殼蛋白感知環境信號後，通過TEC傳遞給病毒內部dsRNA，並激活了轉錄，將cryoEM對病毒的研究從外部“衣殼”深入到了內部“核酸”。 套用cryo-EM揭示了CPV病毒入侵和複製的結構基礎，為研究dsRNA病毒的增殖複製等提供了方法和技術上的借鑑，為基於病毒高分辨結構的功能性靶位篩選和計算機輔助藥物設計(CADD)等提供精確的結構信息。