基於雙底物平行標記實驗的13C代謝通量分析的新方法

《基於雙底物平行標記實驗的13C代謝通量分析的新方法》是依託上海交通大學，由姚瑞蓮擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：基於雙底物平行標記實驗的13C代謝通量分析的新方法
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：姚瑞蓮
• 依託單位：上海交通大學

項目摘要

13C代謝通量分析利用穩定同位素13C對碳源底物進行標記，是定量分析細胞系統強有力的工具。然而適用於雙底物的平行標記實驗鮮有報導。本項目旨在建立基於雙底物平行標記實驗的13C代謝通量分析的新方法，可定量分析雙底物下細胞代謝與底物利用信息，為解除分解代謝阻遏、實現細胞的高效代謝打下基礎。實驗以一株高效共利用甘油和葡萄糖的大腸桿菌為研究對象，依據其代謝網路，合理設計[1-13C]葡萄糖和[1,3-13C]甘油的底物標記模式，建立平行標記實驗方法。然後對照出發菌株和目標菌株，測定參與中心代謝以及目標產物合成途徑的代謝譜水平和轉錄水平。依據各中間代謝物13C的豐度，計算代謝通量。關聯重要的轉錄水平、代謝譜水平與代謝通量水平等數據，建立數學模型以指導代謝過程改造。本研究方法可將13C代謝通量分析擴展到雙底物培養體系，並為雙底物高效共利用機制闡明提供定量分析基礎，具有重要的理論研究意義與套用價值。

結題摘要

13C代謝通量分析是利用13C穩定同位素對底物進行標記，通過標記實驗分析胞內中間代謝物質量同位體的分布情況，從而準確定量胞內反應速率，在系統理解細胞代謝特性和指導代謝工程改造等方面起著重要作用。然而，單一底物標記的代謝通量分析不適用於培養基中存在兩種底物混合培養的情況。隨著組學技術與系統生物學的發展，建立基於雙底物平行標記實驗的13C代謝通量分析的新方法成為可能。本項目以一株高效共利用甘油和葡萄糖的大腸桿菌（ΔptsGglpK*）為研究對象，設計了[1-13C]葡萄糖和[1,3-13C]甘油的底物標記模式，確立了雙底物代謝通量分析的計算方法；完成了目標菌株和出發菌株在基因轉錄水平和中間代謝物水平的差異分析。實驗表明，ΔptsGglpK*以甘油和葡萄糖同時作為碳源時，碳源和能量代謝再分布：快速的甘油攝取影響了NADPH/NADH，降低ATP，激活ArcA調節系統，抑制TCA循環，引起乙酸溢流；葡萄糖從糖酵解途徑流向磷酸戊糖途徑，說明以甘油為主要碳源利用時需添加其他碳源以增加NADPH的供應。基於上述結果，確定了以ΔptsGglpK*為出發菌株合成丙酮醇的關鍵節點，並通過相應的基因工程改造，丙酮醇產量達到1.82 g/L。本項目的研究思路和技術方法為13C代謝通量分析擴展到雙底物培養體系，及雙底物高效共利用機制的闡明奠定了基礎，並為以甘油為主要碳源生物轉化為高價值化學品提供借鑑。