基於紐蟲的自割和吐捕食器解析凝溶膠蛋白的新功能

《基於紐蟲的自割和吐捕食器解析凝溶膠蛋白的新功能》是蘇秀榕為項目負責人，寧波大學為依託單位的面上項目。

基本介紹

• 中文名：基於紐蟲的自割和吐捕食器解析凝溶膠蛋白的新功能
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：蘇秀榕
• 依託單位：寧波大學

項目摘要

凝溶膠蛋白（Gelsolin，GSN）是一種重要的肌動蛋白結合蛋白，可通過對肌動蛋白產生聚合、解聚和剪下等作用，進一步參與細胞運動、凋亡、免疫、腫瘤形成等生理過程中。當組織受損時，肌動蛋白單體大量釋放到細胞外並形成多聚體，導致器官功能損傷，此時GSN則啟動大量表達，通過解離損傷組織中肌動蛋白多聚體的方式起到保護作用。為了充分發揮該蛋白在水產養殖動物中的標記作用，本研究選擇養殖蝦塘中的紐蟲為研究對象，構建紐蟲cDNA文庫、酵母雙雜交文庫；通過PCR技術克隆GSN基因的全長序列，通過原核和真核表達，製備大量GSN表達產物；利用原子力顯微鏡研究GSN與actin的表面形貌和相互作用間的形貌變化，直觀展示其功能。利用螢光定量PCR技術研究GSN與自割和再生的關係，利用酵母雙雜交系統篩選功能蛋白和新功能，利用GSN作為人工養殖大黃魚品質的遺傳標記。

結題摘要

本研究首先從紐蟲cDNA文庫從中克隆出gelsolin全長1947 bp，開放閱讀框為1107 bp，編碼369個胺基酸，蛋白質分子量為42.714 kDa，理論等電點為5.72；Actin全長1830 bp，開放閱讀框為1131 bp，編碼377個胺基酸，蛋白分子量為41.816 kDa，理論等電點為5.30。在1mmol/L IPTG和37℃條件下誘導E.coli表達gelsolin的可溶性蛋白，而actin則以包涵體為主；SDS-PAGE電泳分析表明，gelsolin和actin基因的重組蛋白的分子質量均接近45 KDa。FQ-PCR結果顯示斷裂後5 d，其mRNA表達量約為對照組的19.88倍，推測斷裂後凝溶膠蛋白起到緩解肌動蛋白多聚體對組織造成的毒性效應的作用。AFM結果顯示，純化後的r-gelsolin蛋白直徑約為50~70nm。復性後的r-actin呈球形顆粒，蛋白直徑約為100~200nm；並通過AFM研究了兩者之間的相互作用，r-gelsolin可以通過使r-actin聚集成環或切斷F-actin等方式來控制其結構。MTT法檢測30μg/mL r-gelsolin作用於人胃癌細胞MGC803後的細胞增殖抑制率可達35%，r-gelsolin能有效減緩MGC803細胞生長增殖速率，G1期細胞減少，S/G2期細胞增加並誘導其早期凋亡。雙向電泳表明了70蛋白質參與自割和再生過程，有33種蛋白上調和下調。其中，約79%細胞骨架蛋白和運動蛋白。其中肌動蛋白與凝溶膠蛋白樣蛋白（GSN），兩者均參與了此過程。利用酵母雙雜交技術篩選出一種與凝溶膠蛋白相互作用的鐵蛋白Ferritin。RT-qPCR結果證明了大黃魚隨著死亡的時間，actin和gelsolin 與死亡時間呈負相關。而和炎症以及一些環境變化成正相關。