基於納米材料的雞IFN-γ,IL-4新型檢測方法研究

《基於納米材料的雞IFN-γ,IL-4新型檢測方法研究》是依託揚州大學，由戴華擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：基於納米材料的雞IFN-γ,IL-4新型檢測方法研究
• 依託單位：揚州大學
• 項目負責人：戴華
• 項目類別：面上項目

項目摘要

目前國內外尚無敏感、可靠的在蛋白質水平上分析雞γ-干擾素（IFN-γ）、白細胞介素-4（IL-4）的檢測方法，這直接阻礙了對這類免疫調節因子的研究及對家禽免疫應答的研究，而檢測方法的靈敏度一直是困擾這一問題的關鍵所在。單克隆抗體（mAb）技術的發展極大地豐富和推動了細胞因子檢測方法的發展，而納米粒子具有信號放大作用的特性，將兩者結合有助於大大提高檢測方法的靈敏度，這為建立細胞因子檢測方法提供新思路。本項目採用前期工作中獲得的抗雞IFN-γ、抗 雞IL-4特異性mAb；並引入最佳化的納米粒子，提高檢測方法的靈敏度，研究納米粒子與抗體的複合及其條件，驗證其穩定性；比較納米粒子-抗體複合物ELISA與對照ELISA在靈敏度上的差異。為進一步建立靈敏度高、特異性好的納米放大ELISA方法提供科學依據。

結題摘要

本研究運用抗雞IFN-γ(ChIFN-γ)、抗雞IL-4(ChIL-4)特異性單克隆抗體(mAb)，分別建立檢測ChIFN-γ、ChIL-4的雙mAb夾心ELISA。結果表明，ChIFN-γ雙mAb夾心ELISA的檢測極限達125-500 pg/mL，可檢測重組及天然的ChIFN-γ。且可有效測定出NDV La Sota弱毒疫苗、H5N1禽流感疫苗免疫雞的免疫細胞經特異性抗原再次刺激後激發的抗原特異性IFN-γ水平；建立的ChIL-4雙mAb夾心ELISA的靈敏度實驗結果表明，可檢測到為39 ng/ml 重組ChIL-4。 為進一步提高檢測方法的靈敏度，本研究引入納米粒子，分別建立了如下方法： 一、基於聚硫堇和納米金自組裝修飾的無標記阻抗型免疫感測器檢測ChIFN-γ。在玻碳電極表面通過電化學聚合方法得到聚硫堇，自組裝納米金，將抗ChIFN-γ mAb固定到金納米粒子表面，採用mAb與ChIFN-γ反應前後阻抗的相對變化來實現對ChIFN-γ的檢測。其檢測線性範圍為0.10-1.0×103 ng/mL，檢測限達100 pg/mL，可檢測天然ChIFN-γ。 二、基於PDDA功能化石墨烯納米金複合材料製備無標記阻抗型免疫感測器，實現最佳化檢測ChIL-4。在玻碳電極表面以PDDA功能化的石墨烯和納米金複合材料固定抗體，構建新型無標記阻抗型電化學免疫感測器，快速靈敏地對ChIL-4進行檢測。結果表明阻抗的相對變化值與ChIL-4濃度的對數成正比，其線性範圍為0.50-5.0×103 ng/mL，檢測限為500 pg/mL。 三、流動注射化學發光免疫分析方法，快速高靈敏度檢測ChIFN-γ。將mAb、氧化石墨烯和殼聚糖混合，滴塗於環氧矽烷化的玻璃片表面，然後將固定有mAb的玻璃片置於流通池中，製備感測器。結合流動注射和化學發光檢測系統，採用一步夾心免疫溫育，實現對ChIFN-γ定量檢測。結果表明，ChIFN-γ檢測線性範圍為0.001-0.1 ng/mL，檢測限為0.87 pg/mL，具有較高的靈敏度和特異性。可有效地檢測感染雞血清IFN-γ水平，而未感染的對照雞體IFN-γ水平極低，差異極顯著。 本研究建立的基於納米材料的ChIFN-γ、ChIL-4檢測方法，特異性好，靈敏度高，可用於臨床實際的檢測。