基於探針熔解曲線分析的多位點序列分型技術研究

《基於探針熔解曲線分析的多位點序列分型技術研究》是依託廈門大學，由李慶閣擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：基於探針熔解曲線分析的多位點序列分型技術研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：李慶閣
• 依託單位：廈門大學

項目摘要

多位點序列分型（MLST）利用細菌多個基因座位的序列信息進行分型，具有無歧義和可傳輸的優勢，成為越來越多細菌的標準分型模式。然而，MLST需要多個目標片段的測序分析，成本高，通量低，限制了其套用。已報導的改進模式都不同程度地造成分型分辨能力下降。申請者前期提出多色探針熔解曲線分析技術，顯著提高了基於實時PCR平台的多位點突變檢測水平，已成功用於霍亂弧菌多個管家基因的變異位點分析。本項目擬利用該技術，通過提取等位基因的特異變異位點，實現各等位基因的分型，建立起分辨能力等同於MLST，而在通量、操作簡便性和成本上都更具優勢的新型分型技術- - McMLST。本項目以金黃色葡萄球菌為模型，建立並評價McMLST技術，並分別與MLST和脈衝場電泳分型結果進行對比，探討進一步提升其性能的可能性。鑒於McMLST保持了MLST優點，又提高了分型的效率和易用性，在分型領域應得以廣泛套用。

結題摘要

病原微生物引起的傳染性疾病是全球公共衛生領域面臨的嚴峻課題。通過病原微生物分型，可實現對病原微生物的流行病學調查、跟蹤和阻斷傳播途徑以遏制其暴發流行。理想的病原微生物分子分型技術，應具有分型能力強、操作簡便、重複性好、準確快速、高通量自動化、成本低廉的特點。本項目以金黃色葡萄球菌為模型，建立了一種新型的數位化病原微生物分子分型技術-基於熔解曲線的最小化多位點序列分型 (minim McMLST)。 本項目以金黃色葡萄球菌為模型，建立了三管三重的金黃色葡萄球菌分型體系。該體系檢測15個SNPs位點，理論上可將2151個序列型分成288種MTs。本項目檢測了823份標本，獲得36種MTs，而MLST方法獲得了40種STs。相對於MLST方法，計算出D值為0.9884。進一步利用goeBURST對128份菌株進行了克隆譜系分析，本項目方法未區分的菌株在MLST中均被劃分到了相同的克隆群中，其溯源分析能力與MLST開始趨於一致。標本的分型正確率為97.19%。另外，通過對823標本的耐藥狀態檢測，本項目觀察到熔解類型與菌株的甲氧西林耐藥性表現出明顯的相關性，因此，基因分型對臨床用藥具有潛在的指導價值。 最後，完成了生物信息學分析軟體——McMLST分析軟體的編程與測試並投入使用。該軟體通過已知SNP位點將原始基因序列數據轉化為0/1位點編碼的熔解型數據，並提供分型效率（Simpson指數）、總的分型數目（total-MT）以及一一對應的分型數目（unique-MT）等信息，實現從原始數據到基因型的轉化和自動判讀，從而大大加快分析速度，並提高分析結果判斷的準確性。此外，該軟體的完成，實現了本項目的最終目標——提供一套完整的包括試劑、軟體和操作規程的分型系統。