基於單細胞分析技術探討口蹄疫病毒持續感染機制

《基於單細胞分析技術探討口蹄疫病毒持續感染機制》是依託武漢大學，由鄭從義擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：基於單細胞分析技術探討口蹄疫病毒持續感染機制
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：鄭從義
• 依託單位：武漢大學

項目摘要

口蹄疫是世界動物衛生組織列為必報動物疫病之首的重大動物傳染病。口蹄疫病毒（FMDV）持續感染是口蹄疫爆發的主要原因。因此，解析其持續感染機制對防控口蹄疫爆發至關重要。但由於傳統研究技術的局限，迄今對FMDV持續感染機制仍知之甚少。本項目擬採用螢光激活流式單細胞分選和單細胞螢光定量 RT-PCR等新技術，檢測FMDV持續感染單細胞的感染效率及基因組複製動力學，揭示其病毒載量在單個宿主細胞中分布極端不均勻而導致細胞異質化程度加重的本質；利用單細胞分離培養技術從FMDV持續感染異質化細胞群體中分離易感染、持續感染和不感染3類同質細胞，分析細胞的周期時相及質膜特性變化，探討FMDV持續感染加重宿主細胞異質化進程的機制；藉助RNA干擾和靶向基因敲除技術，在單細胞水平上研究宿主細胞調控因子EBP1和P4HA2f基因的差異表達與功能，從更精細的尺度上探討FMDV形成持續感染的調控機制。

結題摘要

口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)感染引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性和可快速遠距離傳播的動物疫病。被世界動物衛生組織列為必報動物疫病之首，我國也將其定為發生時必須依法上報的重大動物傳染病。研究表明FMD的爆發雖是FMDV急性感染的結果，但急性感染可轉換為持續感染，持續感染在一定條件下又會引發大規模的急性感染，導致FMD的爆發。因此，揭示FMDV持續感染形成和維持的機制，既是消除持續感染隱患的必由之路，也是FMDV持續感染研究亟待解決的重要基礎科學問題。 本項目建立了FMDV感染的流式細胞分選技術，通過流式細胞儀內含的FSC、SSC和細胞周期對感染後的細胞及持續感染細胞進行分選，然後通過單細胞螢光定量RT-PCR、流式細胞分析、感染性實驗、TCID50測定等技術，對不同異質性組份細胞中FMDV的含量進行了測定，發現在大的細胞、內含物高的細胞及G2/M期的細胞中，病毒的含量明顯增多。而後經過吸附實驗、流式細胞分析等實驗，確定了不同異質性細胞內病毒含量不同，主要是發生在吸附階段，這種差異是由於細胞表面的受體表達差異而造成的。 本項目還研究了USP11、MXA和EBP等基因在FMDV感染及持續感染中的功能及調控。特別是對EBP基因功能的研究，我們利用單細胞方式，在不同代次的持續感細胞中進行分析，找出了EBP基因與病毒複製的相關性，確定了該基因在病毒複製中的促進作用。此外，還從FMDV持續感染細胞中分離出持續感染脫毒細胞，我們對正常宿主細胞、持續感染細胞及脫毒細胞進行了轉錄組測序，通過基因的差異表達分析，進一步研究宿主基因在FMDV感染建立、維持過程中的機制，對我們後期進行FMDV持續感染機理的探索及宿主抗病毒機制的分析提供了重要的研究思路。