反向遺傳操作技術（Reverse genetics manipulation technique）是指在體外通過構建RNA病毒的感染性分子克隆，將病毒基因組RNA逆轉錄成cDNA，在DNA分子水平上對其進行各種體外人工操作，由病毒基因組cDNA和各種輔助蛋白來組裝新的RNA病毒的一項研究技術[Neumann G，Whitt M A，Kawaoka Y.Adecade after the generation of a negative-sense RNA virus fromcloned cDNA-what have we learned？Journal of General Virology，2002，83（11）：2635-2662.]，也叫全長感染性cDNA克隆技術，又常被稱為“病毒拯救”。由於最終“拯救”出的RNA病毒來源於cDNA克隆，因此，可通過中間過程中人為加入的DNA環節，在DNA水平上對RNA病毒基因組進行各種體外人工操作，如進行基因突變、基因敲除（缺失）、基因插入、基因置換和基因互補（即構建嵌合病毒）等改造，解決了對RNA病毒基因組難以操作這一難題，極大地方便了人們進行病毒各基因的功能、致病機理和病毒病防制策略的研究，同時為新型疫苗的研製和開發提供了新的思路[Huang Z，Elankumaran S，Panda A，et al.Recombinant Newcastle disease virus as a vaccinevector.Poultry Science，2003，82：899-906.]。
新城疫病毒（NDV）的基因組結構模式為3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，依次編碼6種結構蛋白：核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，NP）、磷蛋白（Phosphoprotein，P）、基質蛋白（Matrix protein，M）、融合蛋白（Fusionprotein，F）、血凝素-神經氨酸酶蛋白（Heamagglutinin-Neuraminidase protein，HN）和大分子蛋白（Large protein，L），此外，P基因轉錄過程中在484位特定的編輯位點（AAAAAGG↓G）插入一或兩個額外的非模板鳥嘌呤核苷酸（G鹼基）發生RNA編輯現象而產生具有相同N末端不同C末端的V和W蛋白[Steward M，Vipond I B，Millar，et al.RN Aediting in Newcastle disease virus.Journal of General Virology，1993，74：2539-2547.]。
不同新城疫病毒分離株之間的毒力差異很大，根據對雞和雞胚的致病性及毒力不同，可將NDV分成三類：即強毒型（速髮型）、中等毒力型（中髮型）和弱毒型（緩髮型）。也可根據人工感染雞的臨診症狀，將NDV分為嗜內臟速髮型、嗜神經速髮型、中髮型、緩髮型和無症狀嗜腸型五種。在感染過程中，NDV吸附蛋白HN首先與敏感細胞表面的唾液酸受體結合，這種結合作用可以引起吸附蛋白HN和融合蛋白F構象發生變化；於是後者的融合肽被釋放出來，使病毒的包膜與細胞膜發生融合[McGinnes L W，Sergel T，ChenH.et al.Mutational Analysis of the Membrane Proximal Heptad Repeat of theNewcastle Disease Virus Fusion Protein.Virology，2001，289：343-352.1]，強毒F蛋白的裂解位點為多個鹼性胺基酸連續排列，可被機體多個組織器官的多種蛋白酶裂解，因此，可導致全身性感染。弱毒株在該區域的鹼性胺基酸則被中性胺基酸所代替，使相應序列由R/K-R-Q-K/R-R-L變為G/E-R-Q-G/E-R-L，這種F蛋白前體僅能被有限的組織或器官分泌的胰樣蛋白酶裂解，感染性很低或無感染性。因此，F蛋白是NDV毒力和致病性的主要決定因素[Peeters BPH，Olays oe leeuw，Koch G，et al.Rescue ofNewcastle disease virus from cloned cDNA：Evidence that cleavability of thefusion protein is a majordeterminant for virulence.Journal of Virology，1999，73（6）：5001-5009.]。
自1926年發現新城疫（ND）以來，ND已發生了四次大的流行，而且每一次流行都有不同基因型的毒株出現，尤其是90年代之後出現了新的基因VII型NDV，給中國的養禽業造成了巨大的經濟損失。在控制疫病的過程中，使用疫苗是最有效最經濟的方法，新城疫的疫苗已使用了幾十年，由於ND疫苗的廣泛使用，此病已基本上得到了較好的控制，但是臨床上非典型ND的發生十分普遍，ND仍然成為威脅養禽業的主要疾病之一，也就是說，常規的疫苗對於NDV強毒的攻擊並不能提供理想的保護。從近十年來的ND流行特點來看，臨床上所分離到的NDV毒株大多數屬於基因VII型[Liu XF，Wan HQ，Ni XX，et al.Pathotypical and genotypical characterization of strain ofNewcastle disease isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in someregions of China during 1985-2001.Archives of Virology，2003，148（7）：1387-1403.]，而常規的ND疫苗株的基因型主要為Ⅰ和Ⅱ型（如V4、LaSota等），因此，在遺傳距離上當前NDV分離株與常規ND疫苗株相差較遠。
2005年Kapczynski等用基因Ⅱ型疫苗株NDV B1株作為疫苗，分別免疫2周齡和8周齡的SPF雞，免疫2周后以2002年的一株NDV分離株進行攻毒試驗，研究結果表明：雖然免疫雞攻毒後沒有發生死亡，但是不能抵抗NDV強毒的感染，免疫雞在攻毒後仍能排毒，因此，Kapczynski等認為常規疫苗在防制當前NDV感染中，還存在明顯的不足，應當進一步改善疫苗當前的生產工藝或者研製新型的替代疫苗[Kapczynski D R，King D J.Protection of chickens against overt clinical disease and determination of viralshedding following vaccination with commercially available Newcastle diseasevirus vaccines upon challenge with highly virulent virus from the Califomia 2002exotic Newcastle disease outbreak.Vaccine，2005，23：3424-3433.]。
2000年黃勇等在發病的鵝群中，成功分離到了基因VII型新城疫強毒ZJ1株，並進行了全基因組測序，登錄號為AF431744[Huang Y，Wang H Q，Liu HQ，et al.Genomic sequence of an isolate of Newcastle disease virus isolated froman out break in geese ：a novel six nucleotide insertion in the non-coding region ofthe nucleoprotein gene.Archives of Virology，2004，149：1445-1457.]。在此基礎上，2005年胡順林等建立了NDV強毒株的反向遺傳操作平台，成功拯救出了鵝源強毒ZJ1株，並對該毒株進行了致弱，但是獲救病毒的EID50和HA效價均較低，不適合於大規模的生產[胡順林，孫慶，吳艷濤等.用反向遺傳技術致弱基因VIId型鵝源新城疫病毒ZJ1株.微生物學報，2007，47（2）：197-200.]。
2005年姚春峰等從發病鵝群中分離到基因VII型NDV毒株JS-5-05-Go，其尿囊液的HA價為8log2明顯高於ZJ1株[姚春峰.中國部分地區新城疫病毒的部分生物學特性鑑定及分子流行病學研究.揚州大學碩士學位論文.揚州，2007，6.]，2007年前有報導NDV的HN蛋白與病毒的繁殖和HA等生物學特性密切相關[Huang Z H，Panda A，Elankumaran S，et al.TheHemagglutinin-Neuraminidase Protein of Newcastle Disease Virus DeterminesTropism and Virulence.Journal ofVirology，2004，74（8）：4176-4184.]。
PCR擴增F和HN基因全長片段（50微升反應體系）：上述RT產物（cDNA）5微升至0.5毫升PCR反應管中，以引物sHN1和sHN2擴增JS-5-05-Go株的HN基因，以引物sF1和sF2擴增JS-5-05-Go株的F基因，具體操作方法如下：10×ReactionBuffer：5微升；sHN1/sF1（50皮摩爾/毫升）：1微升；sHN2/sF2（50皮摩爾/毫升）：1微升；dNTPs（10毫摩爾/升）：1微升；Expand Long Template Polymerase（3.5U/μL）：1微升；上述RT產物（cDNA）5微升；SW：36微升。
PCR反應：以轉錄載體pNDV-VII為模板配製如下PCR反應體系：10×Reaction Buffer：5微升；上游Primer（50皮摩爾/毫升）：1微升；下游Primer（50皮摩爾/毫升）：1微升；dNTPs（10毫摩爾/升）：1微升；Expand Long Template Polymerase（3.5U/μL）：1微升；cDNA：1微升；SW：40微升。
