大腸桿菌（E.coli）是一種引起人體致病的條件致病菌，屬原核微生物。
基本介紹
- 中文名：基因效價
- 外文名：potency of gene
- 類型：大腸桿菌
- 屬於：原核微生物
- 屬性：基因
基本信息,實驗目的,實驗原理,實驗材料,
基本信息
大腸桿菌（E.coli）是一種引起人體致病的條件致病菌，屬原核微生物。該菌主要來源於人畜的大腸中，通過糞便排出體外，隨著環境的變化，發生變異形成一個群落，稱為大腸菌群。這類菌在37℃培養條件下培養24～48小時後能發酵半乳糖，產酸、產氣，是需氧或兼性厭氧的革
蘭氏染色陰性無芽孢桿菌。在人類生活中，以此類菌作為糞便污染指標菌來評價生活飲用水及食品的衛生質量。
噬菌體寄生於大腸桿菌體內，利用大腸桿菌體內的營養物質合成自身，大腸桿菌被裂解而死亡，噬菌體釋放出來，再感染其它大腸桿菌，周
噬菌體寄生於大腸桿菌體內，利用大腸桿菌體內的營養物質合成自身，大腸桿菌被裂解而死亡，噬菌體釋放出來，再感染其它大腸桿菌，周
而復始，故大腸桿菌的剋星是噬菌體（E.coliQT），只要有E.coliQT存在於環境中,大腸桿菌基本消失。
實驗目的
（一）觀察大腸桿菌噬菌體形成噬菌斑的形態；
（二）了解QT效價的測定方法；
（三）熟悉轉導實驗的操作方法。
（二）了解QT效價的測定方法；
（三）熟悉轉導實驗的操作方法。
實驗原理
噬菌體分為兩種類型，一類為烈性噬菌體，一類為溫和性噬菌體（也稱為溶原性噬菌體）。噬菌體對宿主細胞的侵染具有高度的特異性，感染了烈性噬菌體的宿主細胞，烈性噬菌體通過複製、裝配、成熟後要從宿主細胞中釋放出來，而溶原性噬菌體的溶原性細胞經紫外線誘導而裂解出來，在攤布有敏感菌株的瓊脂平板培養基上出現肉眼可見的噬菌斑。不同的噬菌體形成噬菌斑的大小形狀有差異，同一噬菌體所形成的噬菌斑形狀大小基本一致。
不同稀釋度的噬菌體裂解液在雙層瓊脂平板培養基上所形成的噬菌斑的數目不同，通過計算噬菌斑數目可測定噬菌體的效價。
轉導是以溫和性噬菌體為媒介，將供體細胞的遺傳物質轉移到受體細胞中去。當用大腸桿菌雙重溶原菌E.coliK12F2（λ/λgal+）作為供體菌時，可用紫外線進行誘導使其裂解，裂解後的溫和性噬菌體帶有大量的gal+基因的轉導顆粒，這些遺傳物質可轉移給不帶有gal-基因，不能發酵半乳糖的受體菌——E.coliK12F2gal-，使其獲得gal+基因而能發酵半乳糖，可以在EMB瓊脂平板培養基上生成紫黑色帶金屬光澤的菌落，證明轉導己成功。
不同稀釋度的噬菌體裂解液在雙層瓊脂平板培養基上所形成的噬菌斑的數目不同，通過計算噬菌斑數目可測定噬菌體的效價。
轉導是以溫和性噬菌體為媒介，將供體細胞的遺傳物質轉移到受體細胞中去。當用大腸桿菌雙重溶原菌E.coliK12F2（λ/λgal+）作為供體菌時，可用紫外線進行誘導使其裂解，裂解後的溫和性噬菌體帶有大量的gal+基因的轉導顆粒，這些遺傳物質可轉移給不帶有gal-基因，不能發酵半乳糖的受體菌——E.coliK12F2gal-，使其獲得gal+基因而能發酵半乳糖，可以在EMB瓊脂平板培養基上生成紫黑色帶金屬光澤的菌落，證明轉導己成功。
實驗材料
（一）菌種
供體菌：E.coliK12F2gal+——帶有原噬菌體（λ）和缺陷型噬菌體（λgal）能發酵半乳糖。
受體菌：E.coliK12F2gal-——不帶噬菌體不發酵半乳糖，對（λ）噬菌體敏感。
（二）培養基的製備
1、緩衝葡萄糖肉湯培養基：蛋白腖10g；Na2HPO42g；葡萄糖1g；NaCl3g；肉浸液1000ml（或用0.5%的牛肉膏代替）。
製法：稱各藥於肉浸液中，加熱溶解，調PH值至7.4分裝，於121.1℃條件下進行高壓蒸汽滅菌20分鐘。
2、緩衝葡萄糖肉湯固體培養基：按“緩衝葡萄糖肉湯培養基”的各成分配製，再按配製量加入20%的瓊脂即可。製作方法與“緩衝葡萄糖肉湯培養基”相同。
3、雙倍緩衝葡萄糖肉湯培養基：按“緩衝葡萄糖肉湯培養基”各成分的二倍配製，肉浸液仍為1000ml。製作方法與“緩衝葡萄糖肉湯培養基”相同。
4、半乳糖EMB瓊脂平板培養基：蛋白腖10g；K2HPO42g；半乳糖10g；瓊脂20g；2%伊紅液20ml；0.65%美藍液10ml；水1000ml。製法：將蛋白腖、K2HPO4、半乳糖加熱溶解於水中，調PH值至7.6，再加入瓊脂，熔化，於121.1℃高壓蒸汽滅菌15分鐘。
將伊紅和美藍液在沸水浴中滅菌20～30分鐘，先按量將伊紅液加入己溶化的培養基，搖勻後，再加入美藍，再搖勻，立即倒平板，在桌面上輕磨，直到該培養基鋪滿整個平皿底部，放置冷卻即可。
5、半固體普通營養瓊脂培養基：蛋白腖10g；牛肉膏3g；NaCl5g；瓊脂15g；H2O1000ml。製法：除瓊脂外，稱各藥於1/3的水中，加熱溶解後，再加足所需水量，調PH值7.4～7.6，煮沸後加入瓊脂，待瓊脂完全溶化後，分裝。以121.1℃高壓蒸汽滅菌15分鐘即可。
（三）其它
1、含鎂離子的磷酸緩衝液：KH2PO42g；K2HPO47g；MgS04.7H200.25g；H201000ml。
2、氯仿。3、培養皿：7.5cm1套；9cm6套。4、試管20支。5、離心管4支（其中一支配換皮塞）。6、移液管：5ml：5支；1ml：20支；10ml：2支。7、三角瓶：100ml：2個；250ml：3個。8、平頭玻璃勺1支。9、滴管1支。10、離心機。
四、操作方法
（一）噬菌體（λ）裂解液的製備
1、用無菌操作方法從供體菌（E.coliK12F2gal+）斜面試管中挑取一接種環供體菌接種於2ml緩衝葡萄糖肉湯培養基中，放置於37℃恆溫培養箱中培養18小時。
2、18小時後取出，用移液管以無菌的操作方式取1ml供體菌液於9ml緩衝葡萄糖肉湯培養基中，於37℃恆溫培養箱中繼續培養6小時。
3、6小時後取出，將9ml緩衝葡萄糖肉湯培養基移入離心管放於離心機內，離心5分鐘（3000轉/分），棄去上清液，剩下沉澱備用。
4、用移液管向沉澱中加入3ml含鎂離子的磷酸緩衝液重新製成懸浮液，混合均勻後，取出其懸浮液2ml放入直徑為7.5cm的培養皿中，在紅光中放於20W的紫外線燈下，距離50cm打開皿蓋照射10分鐘，立即加入冷卻至45℃左右的雙倍緩衝葡萄糖肉湯培養基2ml，用黑布包好，放於37℃恆溫培養箱內避光培養3小時。
5、3小時後，取出該培養物，用移液管移入帶有棉花塞的離心管中，加入0.2ml的氯仿，劇烈振盪半小時，靜止5分鐘。於離心機內離心10分鐘（3000轉/分），將上清液用移液管移入無菌試管中，此液即為噬菌體（λ）裂解液。
（二）噬菌體效價的測定
1、用無菌操作方法從受體菌E.coliK12F2gal-斜面試管內挑取一接種環受體菌於2ml緩衝葡萄糖肉湯培養基中，於37℃恆溫培養箱內培養18小時後，用移液管吸取1ml培養液加入9ml緩衝葡萄糖肉湯培養基內，於37℃恆溫培養箱內培養6小時。
2、用緩衝葡萄糖肉湯培養基以五倍遞增稀釋法將上述所制的噬菌體（λ）裂解液進行稀釋。
3、用直徑為9cm的無菌平皿5套，每套平皿倒入10ml普通營養瓊脂培養基作為底層培養基。
4、取5支裝有4ml普通營養瓊脂培養基的試管，融化後放入50℃左右的水浴中保溫，然後向每支試管中加入各稀釋度的緩衝葡萄糖肉湯液體培養基培養的E.coliK12F2gal+培養液0.5ml，和緩衝葡萄糖肉湯液體培養基培養的E.coliK12F2gal-培養液0.3ml，搖勻，分別倒入底層己凝固的普通營養瓊脂培養基平皿內作上層，在桌面上輕磨搖勻，待冷卻凝固後，在平皿上用玻璃鉛筆標明稀釋度，置於37℃恆溫箱中培養18～24小時。
5、經培養後，在出現單個噬菌斑的平板上，用接種針在適度的噬菌斑上刺一下，接種於含有E.coli的緩衝葡萄糖肉湯固體培養基的平板中，置於恆溫箱中培養18~24小時，反覆進行，直到平板上出現的噬菌斑的形態大小一致，則QT的效價測定成功。
五、噬菌體效價測定結果如下：
供體菌：E.coliK12F2gal+——帶有原噬菌體（λ）和缺陷型噬菌體（λgal）能發酵半乳糖。
受體菌：E.coliK12F2gal-——不帶噬菌體不發酵半乳糖，對（λ）噬菌體敏感。
（二）培養基的製備
1、緩衝葡萄糖肉湯培養基：蛋白腖10g；Na2HPO42g；葡萄糖1g；NaCl3g；肉浸液1000ml（或用0.5%的牛肉膏代替）。
製法：稱各藥於肉浸液中，加熱溶解，調PH值至7.4分裝，於121.1℃條件下進行高壓蒸汽滅菌20分鐘。
2、緩衝葡萄糖肉湯固體培養基：按“緩衝葡萄糖肉湯培養基”的各成分配製，再按配製量加入20%的瓊脂即可。製作方法與“緩衝葡萄糖肉湯培養基”相同。
3、雙倍緩衝葡萄糖肉湯培養基：按“緩衝葡萄糖肉湯培養基”各成分的二倍配製，肉浸液仍為1000ml。製作方法與“緩衝葡萄糖肉湯培養基”相同。
4、半乳糖EMB瓊脂平板培養基：蛋白腖10g；K2HPO42g；半乳糖10g；瓊脂20g；2%伊紅液20ml；0.65%美藍液10ml；水1000ml。製法：將蛋白腖、K2HPO4、半乳糖加熱溶解於水中，調PH值至7.6，再加入瓊脂，熔化，於121.1℃高壓蒸汽滅菌15分鐘。
將伊紅和美藍液在沸水浴中滅菌20～30分鐘，先按量將伊紅液加入己溶化的培養基，搖勻後，再加入美藍，再搖勻，立即倒平板，在桌面上輕磨，直到該培養基鋪滿整個平皿底部，放置冷卻即可。
5、半固體普通營養瓊脂培養基：蛋白腖10g；牛肉膏3g；NaCl5g；瓊脂15g；H2O1000ml。製法：除瓊脂外，稱各藥於1/3的水中，加熱溶解後，再加足所需水量，調PH值7.4～7.6，煮沸後加入瓊脂，待瓊脂完全溶化後，分裝。以121.1℃高壓蒸汽滅菌15分鐘即可。
（三）其它
1、含鎂離子的磷酸緩衝液：KH2PO42g；K2HPO47g；MgS04.7H200.25g；H201000ml。
2、氯仿。3、培養皿：7.5cm1套；9cm6套。4、試管20支。5、離心管4支（其中一支配換皮塞）。6、移液管：5ml：5支；1ml：20支；10ml：2支。7、三角瓶：100ml：2個；250ml：3個。8、平頭玻璃勺1支。9、滴管1支。10、離心機。
四、操作方法
（一）噬菌體（λ）裂解液的製備
1、用無菌操作方法從供體菌（E.coliK12F2gal+）斜面試管中挑取一接種環供體菌接種於2ml緩衝葡萄糖肉湯培養基中，放置於37℃恆溫培養箱中培養18小時。
2、18小時後取出，用移液管以無菌的操作方式取1ml供體菌液於9ml緩衝葡萄糖肉湯培養基中，於37℃恆溫培養箱中繼續培養6小時。
3、6小時後取出，將9ml緩衝葡萄糖肉湯培養基移入離心管放於離心機內，離心5分鐘（3000轉/分），棄去上清液，剩下沉澱備用。
4、用移液管向沉澱中加入3ml含鎂離子的磷酸緩衝液重新製成懸浮液，混合均勻後，取出其懸浮液2ml放入直徑為7.5cm的培養皿中，在紅光中放於20W的紫外線燈下，距離50cm打開皿蓋照射10分鐘，立即加入冷卻至45℃左右的雙倍緩衝葡萄糖肉湯培養基2ml，用黑布包好，放於37℃恆溫培養箱內避光培養3小時。
5、3小時後，取出該培養物，用移液管移入帶有棉花塞的離心管中，加入0.2ml的氯仿，劇烈振盪半小時，靜止5分鐘。於離心機內離心10分鐘（3000轉/分），將上清液用移液管移入無菌試管中，此液即為噬菌體（λ）裂解液。
（二）噬菌體效價的測定
1、用無菌操作方法從受體菌E.coliK12F2gal-斜面試管內挑取一接種環受體菌於2ml緩衝葡萄糖肉湯培養基中，於37℃恆溫培養箱內培養18小時後，用移液管吸取1ml培養液加入9ml緩衝葡萄糖肉湯培養基內，於37℃恆溫培養箱內培養6小時。
2、用緩衝葡萄糖肉湯培養基以五倍遞增稀釋法將上述所制的噬菌體（λ）裂解液進行稀釋。
3、用直徑為9cm的無菌平皿5套，每套平皿倒入10ml普通營養瓊脂培養基作為底層培養基。
4、取5支裝有4ml普通營養瓊脂培養基的試管，融化後放入50℃左右的水浴中保溫，然後向每支試管中加入各稀釋度的緩衝葡萄糖肉湯液體培養基培養的E.coliK12F2gal+培養液0.5ml，和緩衝葡萄糖肉湯液體培養基培養的E.coliK12F2gal-培養液0.3ml，搖勻，分別倒入底層己凝固的普通營養瓊脂培養基平皿內作上層，在桌面上輕磨搖勻，待冷卻凝固後，在平皿上用玻璃鉛筆標明稀釋度，置於37℃恆溫箱中培養18～24小時。
5、經培養後，在出現單個噬菌斑的平板上，用接種針在適度的噬菌斑上刺一下，接種於含有E.coli的緩衝葡萄糖肉湯固體培養基的平板中，置於恆溫箱中培養18~24小時，反覆進行，直到平板上出現的噬菌斑的形態大小一致，則QT的效價測定成功。
五、噬菌體效價測定結果如下：
QT稀釋度10-110-210-310-410-5對照平板
QT數目43039231518698無
QT效價（數/ml）43×101139×101032×10919×10810×107
六、點滴法轉導實驗
1、取已制好的EMB瓊脂平板培養基3個，在平皿底部用玻璃鉛筆畫線，並標記。
噬菌體（λ）裂解液
↓
QT數目43039231518698無
QT效價（數/ml）43×101139×101032×10919×10810×107
六、點滴法轉導實驗
1、取已制好的EMB瓊脂平板培養基3個，在平皿底部用玻璃鉛筆畫線，並標記。
噬菌體（λ）裂解液
↓
←菌帶
2、用移液管取E.coliK12F2gal-1ml放入EMB瓊脂平板培養基內，用玻璃塗布棒在EMB瓊脂平板培養基上按畫好的線塗出一條菌帶，放入37℃恆溫培養箱內培養6小時。
3、將培養6小時後的帶菌EMB瓊脂平板培養基取出，用接種環沾取噬菌體（λ）裂解液，在菌帶的兩個方格處和方格外各滴接一環，點滴完畢，將EMB瓊脂平板培養基放於37℃恆溫培養箱培養48小時，觀察結果。
4、將接有噬菌體（λ）裂解液的EMB瓊脂平板培養基取出，進行觀察，在EMB瓊脂平板培養基的菌帶上出現了數個呈紫黑色帶金屬光澤的菌落。由此證明，受體菌E.coliK12F2gal-己接受了供體菌E.coliK12F2gal+的DNA片段（基因），能產生分解乳糖的酶，故能分解乳糖。因此，在EMB瓊脂平板培養基上出現紫黑色帶金屬光澤的菌落（該實驗通過多次進行，終於取得成功）。
其失敗的原因有以下幾點，可作參考：
（1）在噬菌斑的測定中，培養24小時後，無任何菌生長，繼續培養至48小時後觀察，有極少數菌落生長，但無噬菌斑出現，其原因可從兩個方面探討：原因一，E.coliK12F2gal+在離心時，由於離心時間較短（原為3分鐘，後為5分鐘）而未沉澱下去，肉眼觀察到離心底部的沉澱很可能是緩衝葡萄糖肉湯培養基中的其它雜質。故無噬菌體；原因二，E.coliK12F2gal+培養物在進行紫外線照射誘導後，再加氯仿後振盪不充分，而未能使供體菌內的噬菌體裂解出來，故無噬菌斑。
（2）在DNA的轉導實驗中，菌帶上有菌落且生長良好，但未見紫黑色帶金屬光澤的菌落出現，由此證明，受體菌E.coliK12F2gal-未能接受到供體菌E.coliK12F2gal+的DNA的片斷（基因），由於無分解乳糖的基因，就不能產生分解乳糖的酶，因而就不能利用乳糖，故未出現紫黑色帶金屬光澤的菌落。
3、將培養6小時後的帶菌EMB瓊脂平板培養基取出，用接種環沾取噬菌體（λ）裂解液，在菌帶的兩個方格處和方格外各滴接一環，點滴完畢，將EMB瓊脂平板培養基放於37℃恆溫培養箱培養48小時，觀察結果。
4、將接有噬菌體（λ）裂解液的EMB瓊脂平板培養基取出，進行觀察，在EMB瓊脂平板培養基的菌帶上出現了數個呈紫黑色帶金屬光澤的菌落。由此證明，受體菌E.coliK12F2gal-己接受了供體菌E.coliK12F2gal+的DNA片段（基因），能產生分解乳糖的酶，故能分解乳糖。因此，在EMB瓊脂平板培養基上出現紫黑色帶金屬光澤的菌落（該實驗通過多次進行，終於取得成功）。
其失敗的原因有以下幾點，可作參考：
（1）在噬菌斑的測定中，培養24小時後，無任何菌生長，繼續培養至48小時後觀察，有極少數菌落生長，但無噬菌斑出現，其原因可從兩個方面探討：原因一，E.coliK12F2gal+在離心時，由於離心時間較短（原為3分鐘，後為5分鐘）而未沉澱下去，肉眼觀察到離心底部的沉澱很可能是緩衝葡萄糖肉湯培養基中的其它雜質。故無噬菌體；原因二，E.coliK12F2gal+培養物在進行紫外線照射誘導後，再加氯仿後振盪不充分，而未能使供體菌內的噬菌體裂解出來，故無噬菌斑。
（2）在DNA的轉導實驗中，菌帶上有菌落且生長良好，但未見紫黑色帶金屬光澤的菌落出現，由此證明，受體菌E.coliK12F2gal-未能接受到供體菌E.coliK12F2gal+的DNA的片斷（基因），由於無分解乳糖的基因，就不能產生分解乳糖的酶，因而就不能利用乳糖，故未出現紫黑色帶金屬光澤的菌落。
