《嗜熱菌Thermus thermophilus HB8鐵硫簇SUF合成途徑的研究》是依託首都師範大學，由劉曉晴擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：嗜熱菌Thermus thermophilus HB8鐵硫簇SUF合成途徑的研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：劉曉晴
- 依託單位：首都師範大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
鐵硫簇廣泛分布於古細菌、細菌、真核生物中，參與電子傳遞、酶活的調控等重要生物功能。鐵硫簇生物合成途徑至少有三個系統NIF、ISC和SUF，都由脫硫酶催化半胱氨酸脫-SH提供硫原子，由鐵載體提供鐵原子，在骨架蛋白（scaffold）上進行組裝並將鐵硫簇轉移到受體蛋白的脫輔基蛋白（Apo-protein）上形成全蛋白（Holo-protein）後行使生理功能。嗜熱菌Thermus thermophilus HB8中存在較為完整的SUF體系，是進行鐵硫簇SUF合成途徑研究的很好材料，而且嗜熱菌蛋白具有熱穩定性，有利於體外蛋白純化及晶體生長。本項目意在結合嗜熱菌蛋白特性，在體外研究SUF系統中尚未解決的問題，幾種可能的骨架蛋白的結構與作用機理以及在鐵硫簇組裝過程中涉及的蛋白質的相互作用所形成的蛋白複合體的結構和功能的探討。為下一步系統性了解SUF系統的作用機理奠定基礎。
結題摘要
鐵硫簇是一種古老且很重要的無機輔因子，廣泛存在於各種基礎生命活動中，在細胞的生物學過程中起著重要的作用，可參與電子傳遞和基因調節等過程。現已發現細菌中主要鐵硫簇合成途徑有三種類型，即為ISC，NIF和SUF系統。ISC系統由iscSUA-hscBA-fdx基因串編碼，合成的是一類“管家”蛋白，適於在正常條件下表達。NIF系統由nifSU基因編碼，適於固氮酶（厭氧條件下起作用）鐵硫簇的合成。SUF系統由基因串sufABCDSE編碼，常在惡劣環境如氧化應激和鐵飢餓條件下表達。但是在Thermus thermophiles HB8 中存在較為完整的而且唯一的SUF體系，是進行鐵硫簇SUF合成途徑研究的很好材料。SUF途徑主要包括sufABCDSE這樣一個基因簇，分別編碼SufA、SufB、SufC、SufD、SufS和SufE這六種蛋白。 本課題以Thermus thermophiles HB8全基因組為模板，通過PCR技術，分別獲得sufA、sufB、sufC、sufD、sufS、sufE基因，並成功將目的基因分別連線到表達載體pET28a(+)和pGEX-6P-1上，構建重組質粒。重組質粒轉化E.coli BL21後，獲得大量表達，通過親和層析與蛋白凝膠過濾層析等方法將其分別純化。並通過共表達和共轉化等方法成功表達複合體SufBC、SufCD、SufBCD蛋白。 對蛋白的功能研究表明：SufS具有半胱氨酸脫硫酶活性，SufE沒有脫硫酶活性，但SufE存在會使SufS活性增強，摸索體外重組的條件發現在60 ℃孵育1.0-2.5 h效果比較好，其活性是單體SufS的2倍左右；SufC蛋白具有ATP水解酶活性，使用一個三偶聯的方法測定SufC ATPase活性。 SufC可以與SufB，SufD相互作用形成複合體SufBC，SufCD，SufBCD。這些複合體的形成均可以提高SufC ATPase活性。同時在複合體SufBCD 存在時，SufS半胱氨酸脫硫酶的活性也被提高。 體外重組實驗表明：SufS與SufE可在體外重組為複合體，但是通過非共價鍵連線的，暫時的，不利於複合體的獲取。而通過交聯劑Mts-Atf-Biotin使SufS與SufE共價交聯後，不僅複合體SufSE穩定性增加，而且半胱氨酸脫硫酶的活性亦大大增加，此時SufSE酶活性是單體的6倍左右，活性可持續72小
