《嗜熱古菌Pyrococcus furiosus DNA聚合酶的生化性質及校讀機制》是依託揚州大學，由張立奎擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：嗜熱古菌Pyrococcus furiosus DNA聚合酶的生化性質及校讀機制
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：張立奎
- 依託單位：揚州大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
海洋沉積物中的嗜熱古菌Pyrococcus furiosus DNA聚合酶是研究古菌DNA聚合酶的模式酶。本項目的前期工作對B家族DNA聚合酶的胺基酸序列進行了比對，並初步研究了Pfu DNA聚合酶高溫條件下結合DNA。在此基礎上，本項目擬利用分子生物學技術，構建Pfu DNA聚合酶突變體，包括胺基酸取代突變體、β-hairpin缺失突變體和Pfu/T4β-hairpin嵌合體。採用引物延伸法、引物降解法、凝膠阻滯實驗、螢光分析和預穩態動力學技術研究Pfu DNA聚合酶及其突變體高溫條件下的聚合活性、外切活性和結合DNA的模式。研究的目的是闡明古菌DNA聚合酶高溫條件下聚合活性和外切活性的調控機制、高保真的機制和校讀活性機制。項目的研究成果不僅能揭示高溫古菌的複製DNA機理，而且還能揭示來源不同的B家族DNA聚合酶能夠在不同環境中複製DNA的機理，有助於我們認知極端生命特徵和環境適應機理。
結題摘要
DNA聚合酶是DNA複製、DNA修復和DNA重組過程中的核心酶，參與了DNA測序、擴增、定點突變、標記等反應，在分子生物學領域具有廣泛的套用。本項目構建了一系列對聚合活性和外切活性具有潛在影響的Pfu DNA聚合酶突變體，純化了部分突變體蛋白，初步研究了Pfu DNA聚合酶突變體的PCR擴增效率。研究發現，L409，I540，G544是影響Pfu DNA聚合酶聚合活性的重要胺基酸殘基，並推測 G155、T208、A408、Q462和K508是影響Pfu DNA聚合酶聚合活性和外切活性平衡的關鍵胺基酸殘基。本項目綜述了極端嗜熱古菌DNA聚合酶在生物技術領域中的套用。此外，本項目構建了藥物敏感型T4噬菌體DNA聚合酶突變體G466S、G466S/Y460F和V475W，分析了其突變頻率。研究結果表明，G466S/Y460F T4噬菌體具有與單皰疹病毒DNA聚合酶相似的藥物敏感性。項目成果首次揭示了T4噬菌體DNA聚合酶和單皰疹病毒DNA聚合酶分別對藥物抗性和敏感性的分子機制，為篩選抗單皰疹病毒藥物提供重要的靶標。本項目關於DNA聚合酶的研究成果有助於我們進一步認知DNA聚合酶的功能。 源自中溫噬菌體HNH核酸內切切刻DNA，在噬菌體生活周期中起著非常重要的作用。但是，關於嗜熱噬菌體HNH核酸內切酶的研究，尚未報導。本項目首次開展了深海嗜熱噬菌體GVE2 HNH的核酸內切酶生化性質和晶體結構的研究。研究發現，GVE2 HNH核酸內切酶切割DNA的最適溫度在60-65℃，最適pH為8.0-9.0。GVE2 HNH核酸內切酶切割DNA依賴於二價金屬離子，Mn2+存在時，該酶切割DNA的效率最高。本項目解析了GVE2 HNH核酸內切酶的晶體結構， H93、N109和H118組成了該酶的活性中心。進一步研究發現，H93A、N109A和H118A的胺基酸取代分別引起了GVE2 HNH核酸內切酶活性損失96%、86%和66%。上述研究成果為揭示GVE2 HNH核酸內切酶在噬菌體GVE2生活周期所起的作用提供了理論依據。 此外，本項目利用高通量測序技術首次研究了西南印度洋深海沉積物的細菌、古菌和真菌的群落組成，為推動該環境中深海微生物資源的開發提供了重要的參考。 本項目已發表論文7篇，其中SCI收錄5篇，申請相關專利1個，完成了項目任務書中的研究目標。
