《單酶催化多步連續反應中底物結合模式研究》是依託天津大學，由姚明東擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：單酶催化多步連續反應中底物結合模式研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：姚明東
- 依託單位：天津大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
在生物代謝過程中存在一類可催化多步連續反應的通用酶，例如脫氫酶CrtI可以催化八氫番茄紅素髮生多步連續脫氫反應依次生成鏈孢紅素和番茄紅素等多種產物。若能夠明確單酶催化多步連續反應中各步反應底物與酶的結合機制，就能理解單酶催化多步連續反應機制，促進該類酶在人工細胞構建中的貢獻。申請人構想從位移模式和形變模式入手，通過酶-底物複合體結構模擬分析和體外酶反應動力學測定相結合的技術手段，闡明各步反應底物與酶的結合機制，進而研究多步連續反應中酶與底物的結合模式。本項目以脫氫酶CrtI為例，構建CrtI與各步反應底物複合體的結構模型，表征CrtI及其關鍵突變體的體外酶反應動力學特徵。在此基礎上比較分析酶與底物複合體的結構模型和結合機制，闡明多步連續反應中酶與底物的結合模式。本項目將創新對單酶催化多步連續反應中酶結合各步底物的認知，為研究酶的產物抑制作用和多步連續反應機制提供了重要的參考依據。
結題摘要
物種的進化導致了酶的精細分工。脫氫酶CrtI可以催化多步連續脫氫反應，不同物種的脫氫反應步驟不同。然而，控制脫氫步驟的結構特徵尚不清楚。若能夠明確單酶催化多步連續反應中各步反應底物與酶的結合機制，就能理解單酶催化多步連續反應機制，促進該類酶在人工細胞構建中的貢獻。申請人構想從位移模式和形變模式入手，通過酶-底物複合體結構模擬分析和酶功能表征相結合的技術手段，闡明各步反應底物與酶的結合機制，進而研究多步連續反應中酶與底物的結合模式。本項目利用定向進化技術模擬自然進化過程，對四步脫氫酶BtCrtI的脫氫功能的改變，確定了兩個陽性突變體H136R和H453R，使脫氫反應步驟分別減少了近3步和2步。並通過系統發育分析和序列比對對關鍵突變位點進行了進化分析。然後通過分析CrtI與底物複合體的結構模型以及CrtI及其關鍵突變體的酶催化反應的產物成分特徵，闡明和最佳化這類酶進化過程的構效關係。為了進一步研究BtCrtI的功能轉換，我們還嘗試了BtCrtI的H136和H453位點的飽和突變。採用主成分分析(PCA)和k-均值聚類算法對結果進行解釋。根據聚類結果，我們將每個類別中具有代表性的突變體組合起來進行進一步分析。本研究確定了調控BtCrtI脫氫步驟的關鍵位點，並提出了相關的結構進化假說，為酶進化理論提供了新的內容。
