單核細胞增生李斯特菌Hfq互作sRNA的發掘及其功能解析

《單核細胞增生李斯特菌Hfq互作sRNA的發掘及其功能解析》是依託揚州大學，由殷月蘭擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：單核細胞增生李斯特菌Hfq互作sRNA的發掘及其功能解析
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：殷月蘭
• 依託單位：揚州大學

項目摘要

Hfq蛋白和sRNA是人獸共患致病菌單核細胞增生李斯特菌中新發現的毒力調控因子，目前它們在LM生長代謝及毒力調控中的作用研究甚少。本研究首先採用免疫共沉澱方法，從野生株體外脅迫下培養物的總RNA中釣取sRNA，並利用RACE技術、Northern blot 和凝膠阻滯實驗，對其cDNA序列、體外結合活性及表達豐度進行研究。然後採用蛋白質組學技術、Real-time PCR等分子生物學實驗技術和免疫學實驗技術，以sRNA突變株、hfq突變株和野生株為材料，通過體外脅迫培養、細胞感染和小鼠感染實驗，對其表型特徵、抗脅迫能力、毒力因子轉錄譜、差異蛋白表達及細菌致病力等進行深入研究，揭示與Hfq互作sRNA在LM對環境壓力應答和致病性中的調控作用。本研究有助於闡明LM致病的分子調控機理，為抗LM感染提供新的藥物靶標，為李斯特菌病的預防與控制奠定理論基礎。

結題摘要

利用同源重組技術分別成功構建了單核細胞增生性李斯特菌EGDe菌株及NTSN菌株hfq基因的缺失株，對重組克隆用PCR方法和RT-PCR方法均證實靶基因被成功敲除，將陽性克隆命名為EGDe△hfq、NTSN△hfq。另外，將hfq基因及其啟動子序列構建進pERL3質粒中，通過電轉化的方法導入感受態細胞NTSN△hfq中，獲得hfq基因回復株，命名為NTSN△hfq-hfq。對親本株、hfq缺失株及回復株的生長曲線、生理生化特性、溶血活性進行了測定。實驗結果表明，EGDe△hfq、NTSN△hfq的生長趨勢與野生株相似，溶血活性未發生明顯變化，但EGDe△hfq喪失α葡萄糖苷酶活性，NTSN△hfq喪失亮氨酸芳胺酶活性及乳糖氧化能力，表明hfq基因的缺失對細菌正常的生長未造成明顯影響，但對碳源、氮源代謝途徑中的特定代謝通路造成一定的影響。 通過體外脅迫培養、細胞侵襲和小鼠感染實驗，對其表型特徵、抗脅迫能力及細菌致病力等進行研究。實驗結果表明：於4℃低溫環境下，缺失株生長較野生株顯著下降(p＜0.05)，在含7% NaCl高滲BHI培養基及4.5%乙醇的BHI培養基中，缺失株生長受到明顯抑制。此外， EGDe△hfq和NTSN△hfq對1% TritonX-100敏感性顯著增加，在BHI、膽鹽培養基中，缺失株形成生物膜的能力顯著下降(p＜0.05)，對Caco-2細胞系的侵襲能力降低。突變株對BALB/c小鼠的毒力測定結果表明，EGDe△hfq半數致死劑量比野生型菌株提高6倍，毒力顯著降低，NTSN△hfq半數致死劑量比野生型菌株提高16倍，毒力顯著降低。上述實驗結果表明，Hfq蛋白對Lm抗脅迫、生物膜形成及細菌毒力具有重要的調控作用。 利用同源重組技術敲除了5個snRNA,獲得5株snRNA缺失的突變株。體外生長曲線測定結果表明，缺失株的生長曲線和野生株之間無顯著性差異；，對巨噬細胞P388D1的侵襲實驗結果表明，其中有2個突變株的侵襲率顯著低於野生菌株EGDe。對小鼠的感染實驗表明，缺失株在小鼠肝臟和脾臟中的細菌載量顯著低於野生菌株。以上實驗表明，這兩個snRNA對單核細胞增生李斯特菌在體內的致病性發揮重要作用。 缺失株的構建及其生物學特性的測定為進一步研究Hfq、snRNA的功能提供了材料，為研究其在Lm脅迫環境生存及疾病預防控制奠定了基礎。