《古細菌CCC1家族鐵/錳離子跨膜轉運蛋白的結構生物學研究》是劉翔宇為項目負責人，北京大學為依託單位的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：古細菌CCC1家族鐵/錳離子跨膜轉運蛋白的結構生物學研究
- 項目類別 ：青年科學基金項目
- 依託單位 ：北京大學
- 項目負責人：劉翔宇
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
CCC1家族蛋白是一類跨膜轉運鐵或錳離子的膜蛋白。該家族蛋白通常有250-400個胺基酸，5次跨膜螺旋。目前國際上尚未解析此家族蛋白的高解析度結構。.本研究計畫解析古細菌CCC1家族鐵離子轉運蛋白的高解析度三維結構，闡明鐵離子跨膜轉運的機理。.研究內容包括用大腸桿菌異源表達目的蛋白，用鎳柱親和、凝膠阻滯等層析方法純化蛋白，再用多種商業化結晶試劑盒篩選晶體。晶體初篩時會使用傳統的低去垢劑濃度低脂質濃度的二型膜蛋白晶體生長法，最新發展的高去垢劑濃度高脂質濃度的HiLiDe一型膜蛋白晶體生長法以及LCP脂立方相膜蛋白晶體生長方法。.獲得初始晶體後，對去垢劑、pH值、沉澱劑及鹽濃度等進行精細最佳化以得到最優晶體，在同步輻射光源測試晶體衍射能力，收集衍射數據。同時，通過浸泡重金屬化合物和硒代甲硫氨酸修飾目的蛋白的方法獲取相位信息進而解析結構。基於結構分析和活性實驗結果，使鐵離子跨膜轉運的機理得到闡明。
結題摘要
過渡金屬元素如鐵、銅、鋅、鈷等是維持人體健康所必須的微量元素。一方面這類元素作為金屬酶的組成部分結合在蛋白質上直接參與生命過程，另一方面過量的過渡金屬元素具有生物毒性。因此生物體需要嚴格的調控細胞內金屬元素的濃度。CCC1家族蛋白是一類跨膜轉運鐵離子或錳離子的膜蛋白，以次級轉運的方式調控胞內的鐵離子濃度，通常具有200-350個胺基酸，N端具有類鐵蛋白結構域(ferritin-like domain), C端具有五次跨膜螺旋。其高解析度三維結構尙未被解析，鐵離子跨膜轉運機理也不明了。 本課題克隆了嗜酸熱硫化葉菌CCC1家族鐵離子轉運蛋白，並成功在大腸桿菌中異源表達了目的蛋白。通過最佳化去垢劑條件、最佳化純化策略等步驟，得到了高純度的目的蛋白。純化後的蛋白被用於晶體篩選。在嘗試了多種不同的去垢劑，包括β-OG，β-DDM，LDAO，DM，C12E8，MNG等去垢劑之後，在DM作為主要去垢劑的條件下獲得了蛋白質晶體。在晶體篩選過程中，我們發現大腸桿菌的HFQ蛋白，即便在含量低於5% 的情況下，也能長出雜蛋白晶體，該發現對於其他從事結構生物學研究的人具有借鑑意義。 晶體最佳化過程並不順利。儘管在最佳化過程中我們對結晶條件，包括鹽、沉澱劑、緩衝液做了細緻系統的最佳化，也嘗試了不同的去垢劑、脂質添加劑，而且對蛋白本身進行了點突變等修飾，最後拿到晶體的衍射能力始終無法超過6埃。 考慮到目的蛋白的N端類鐵蛋白結構域本身也能提供鐵離子被富集再被轉運的信息。在本課題中我們也嘗試了只結晶N端結構域。在測試不同表達片段後，我們成功表達並純化了N端片段。該片段長出了針簇狀晶體。不過晶體衍射能力非常弱。 在本課題研究過程中，我們成功獲得了目的蛋白的晶體，這是通往成功地一大突破。課題在獲得高解析度衍射數據的這一步受到了阻礙。儘管付出了大量的工作，晶體解析度始終無法突破6埃。這是膜蛋白晶體學研究中常遇到的問題。雖然本課題沒有獲得CCC1蛋白的精細三維結構，但是鑑定出初始結晶條件為今後同領域的研究指出了方向。
