原卟啉原氧化酶突變體的性質研究與預測

《原卟啉原氧化酶突變體的性質研究與預測》是依託南開大學，由文欣擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：原卟啉原氧化酶突變體的性質研究與預測
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：文欣
• 依託單位：南開大學

中文摘要

農藥靶酶對農藥的抗性已經成為農業生產中一個值得關注的問題。開展農藥靶標抗性的分子機制研究，建立抗性預測方法，對於設計開發抗性綜合治理藥物，以延長藥物使用壽命，減緩抗性的發生以及實現農藥抗性的早期預警都具有十分重要的意義。在本項目中，我們將除草劑靶酶原卟啉原氧化酶及突變體庫的構建及酶學性質的研究、該酶及突變體與農藥相互作用的研究、該酶突變體性質的預測方法研究三方面作為有機整體開展工作。深入探討酶底物、農藥分子與靶酶及突變體之間的相互作用規律及其結構基礎。發展建立基於分子動力學模擬結果的統計表征的突變酶性質預測方法。這一方法預期可以預測農藥靶酶突變體的酶學性質及對農藥的抗性，綜合評價靶酶突變體自然突變的影響。有望成為基於分子動力學模擬結果的統計表征的農藥靶酶突變體酶學性質及抗性預測的普適方法。

結題摘要

廣泛存在於動物、植物、真菌和細菌中原卟啉原氧化酶（protoporphyrinogen oxidase, PPO，EC 1.3.3.4）是一個具有重要農學和醫學意義的生物靶標。其催化原卟啉原IX氧化為光敏物質原卟啉IX，是葉綠素和亞鐵血紅素相同生物合成途徑中的最後一個酶。PPO酶被抑制或自身缺損，會導致原卟啉IX過度積累並在光照和氧氣存在下，發生光動力學反應，最終導致細胞死亡。人體中PPO的異常是導致混合型卟啉症 (Variegated Porphyria，VP )的直接原因。醫學上，PPO酶被用於光動力學方法治療癌症；農業中，PPO酶是一類光敏型除草劑的重要標靶。因PPO非植物所特有，考慮到人畜及環境安全，種屬選擇性是針對該靶標設計、開發除草劑的關鍵問題。而除草劑抗性的出現，使除草劑開發之初綜合考慮抗性規避成為必然。 靶標特異性為實現藥物特異性提供了基礎。本質上，種屬選擇性藥物及抗性規避藥物的設計開發，均依賴於對我們對一組靶酶（源於不同種屬或若干突變體）性質規律性的認識及在此基礎上預測方法的建立。 本項目綜合運用分子生物學、生物化學、結構生物學、計算化學等技術，開展了多種屬PPO酶及突變體庫的構建及酶學性質研究，完成近80個種屬PPO酶序列的全基因合成， 10個種屬PPO酶的表達、純化及酶學性質（Km、kcat、Kc等）研究，3個種屬、近50個PPO酶突變體基因重組表達體系的構建。培養及解析了PPO酶及其突變體與其抑制劑複合物晶體結構4個。完成三個代表性種屬（人、菸草、枯草芽孢桿菌）PPO酶底物結合模式的研究，為種屬選擇性抑制劑設計提供了結構基礎。完成不同種屬PPO酶及近百個突變體的分子動力學模擬研究，闡釋了酶活性的動態結構機制。通過對體系平衡態構象集的統計分布研究，提出優勢構象群（Privileged conformation）概念，發現優勢構象群的機率決定靶酶活性，據此建立了PPO酶活性定量預測方法（Prenzyme）。通過進一步對酶功能核心區域胺基酸功能研究，提出：胺基酸作用網路的動態平衡，影響優勢構象群機率，進而影響蛋白功能的“動態調控機制”（ Dynamics regulates Kinetics Hypothesis）。