《利用小分子探針研究CD38的膜拓撲學》是依託北京大學，由李漢璋擔任負責人的重大研究計畫。
基本介紹
- 中文名：利用小分子探針研究CD38的膜拓撲學
- 項目負責人：李漢璋
- 依託單位：北京大學
- 項目類別：重大研究計畫
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
鈣離子活動對於幾乎所有的細胞功能都是非常重要的。我們早前發現了兩條全新的鈣離子相關的信號通路：cADPR和NAADP信號通路，而且發現CD38是哺乳動物細胞合成這兩個信使的關鍵酶。但是CD38的拓撲學悖論——活性結構域和底物/產物靶位位於生物膜的異側——一直阻礙著人們對這條通路的深入認識。為了解決這個悖論，我們提出了“III型CD38”存在假說，並利用針對CD38氨基端的特異性抗體首次觀測到了細胞表面的III型CD38。本項目將從以下三個方面去進一步論證它的分布和可能機制。它的順利進行不僅可以為細胞內鈣離子信號轉導提供研究工具，而且可以為該新型通路的內在調節機制提供有價值的見解。.目標1、設計膜通透性拮抗劑來研究CD38的拓撲學方向；.目標2、設計胞內表達的納米抗體研究III型CD38的分布；.目標3、脂質電荷對CD38拓撲學方向的影響。
結題摘要
CD38是一個淋巴細胞的表面蛋白，它的表達與細胞發育和分化相關；另外，作為表面分子，CD38與其他抗原，例如CD4等相互作用，保護細胞免受HIV的感染。我們課題組在多年前發現了CD38的ADP核糖環化酶活性，從此開創了一個研究CD38信號酶功能的新領域。該領域發展至今，有一個不得不解決的拓撲學問題：即解釋催化活性區位於胞外的酶，催化生成胞內第二信使物質的機制。為解決這個問題，我們提出了III型CD38的假說，即有部分CD38存在催化結構域朝向胞內的形式。 針對上述假說，我們從以下幾個方面開展了研究工作： 1. 設計並製備膜通透性CD38的拮抗劑，CZ27-AM。通過向CD38的極性拮抗劑CZ27上引入酯基-AM基團，增加該拮抗劑的膜透性，並使其在胞質內富集，特異性抑制胞內CD38的活性。本部分化學合成工作已完成，活性測試發現CZ-27-AM對多發性骨髓瘤LP-1細胞的CD38活性有抑制作用，導致胞內cADPR水平下降。 2. 選擇CD38的第四個糖基化位點，製備了特異針對非糖基化多肽的抗體，因此它只能識別非糖基化的III型CD38，因為II型CD38的表位被糖鏈阻斷。利用該抗體，我們系統研究了CD38 N端的正電胺基酸、可能被磷酸化的絲氨酸以及可能被棕櫚酸話的半胱氨酸對於CD38膜拓撲學的決定作用。該部分的工作最近已經發表在期刊Biochim Biophys Acta.（2015 Sep;1853(9):2095-103）上，並獲得同行在F1000Prime推薦。 3. 製備了一系列CD38的納米抗體，並獲得了它們與CD38複合物的晶體結構，鑑定了三個表面抗原決定簇以及相應的納米抗體。利用這些抗體，構建了胞內抗體以及雙分子螢光互補技術（BiFC）抗體對，來識別胞內III型CD38。部分結果已經整理，投稿中。 4. 研究質膜脂質成分對CD38拓撲學方向的作用。 採用帶有功能性微粒體的體外翻譯系統，根據糖基化和蛋白酶敏感性判斷CD38朝向；然後改變微粒體中PI或PE的成分觀察CD38朝向變化。本部分內容尚未完成，遇到的困難是體外翻譯系統建立不成功，現正嘗試細菌表達體系。 在項目執行期內，課題在原定方向都取得了突破，特別是CD38拓撲學方向決定性因素方面的成果已得到發表並獲得同行認可。 該課題有助於闡釋CD38信號作用機制，深化對其相關生理病理作用的認識。
