分子克隆實驗指南精編版

基本信息

分子克隆實驗指南精編版

所屬類別

科技 >> 生物 >> 生物科學

作者：[美]J.薩姆布魯克、D.W.拉塞爾 著

叢書名：生物實驗室系列

出版日期：2008年1月 書號：978-7-122-01148-0

開本：16 裝幀：平 版次：1版1次 頁數：716頁

內容簡介

本書是《分子克隆實驗指南》第三版的精編版，著者將原第三版的實驗材料和操作技術部分抽出來並進行了適當的修正，從而使三卷本的大作匯成了精悍的一本。精編版囊括了原第三版中的“step—by—step”實驗方案以及精心選擇的附錄部分，經原第三版的相同譯者翻譯並認真校訂為中文，在準確性、實用性方面都有所增強。

目錄

第1章分子克隆中使用的質粒載體的製備

方案11SDS鹼裂解法製備質粒DNA：小量製備1

方案12SDS鹼裂解法製備質粒DNA：中量製備3

方案13SDS鹼裂解法製備質粒DNA：大量製備5

方案14煮沸法小量製備質粒DNA7

方案15煮沸法大量製備質粒DNA9

方案16用牙籤挑取菌落小量製備質粒DNA11

方案17SDS裂解法製備質粒DNA13

方案18聚乙二醇沉澱法純化質粒DNA15

方案19層析法純化質粒DNA17

方案110氯化銫溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環DNA：連續梯度法18

方案111氯化銫溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環DNA：不連續梯度法20

方案112有機溶劑萃取法從DNA中去除溴化乙錠22

方案113離子交換層析法從DNA中去除溴化乙錠24

方案114NaCl離心法去除質粒DNA樣品中的小片段核酸25

方案115Sephacryl S1000層析法去除質粒DNA樣品中的小片段核酸26

方案116氯化鋰沉澱法去除質粒DNA樣品中的小片段核酸28

方案117在質粒載體中進行定向克隆29

方案118在黏性末端上連線接頭31

方案119在質粒載體中進行平末端克隆33

方案120質粒DNA的去磷酸化36

方案121平末端DNA連線合成的接頭38

方案122在低熔點瓊脂糖中連線質粒和目的DNA40

方案123製備和轉化大腸桿菌感受態的Hanahan方法：高效的轉化方法42

方案124製備和轉化感受態大腸桿菌的Inoue方法：超級感受態細胞45

方案125氯化鈣製備大腸桿菌感受態48

方案126大腸桿菌的電轉化50

方案127用Xgal和IPTG篩選細菌克隆：α互補52

方案128小量細菌克隆的雜交篩選53

方案129中量細菌克隆的雜交篩選54

方案130大量菌落的雜交篩選56

方案131菌落的裂解和DNA與濾膜的結合58

方案132在濾膜上進行細菌DNA的雜交59

第2章λ噬菌體及其載體

方案21λ噬菌體的平板培養63

方案22λ噬菌體噬菌斑的挑取65

方案23通過平板裂解和洗脫製備λ噬菌體原種66

方案24用小量液體培養製備λ噬菌體原種68

方案25λ噬菌體的大規模培養：低倍數感染69

方案26從大規模裂解物中沉澱λ噬菌體顆粒70

方案27通過凝膠電泳測定λ噬菌體原種和裂解物中DNA的含量72

方案28通過CsCl等密度梯度離心純化λ噬菌體顆粒73

方案29通過甘油分級梯度離心純化λ噬菌體顆粒76

方案210通過沉澱/離心純化λ噬菌體顆粒77

方案211用蛋白酶K和SDS從大規模培養物中提取λ噬菌體DNA78

方案212用甲醯胺從大規模培養物中提取λ噬菌體DNA79

方案213用作克隆載體的經單一限制性酶切割的λ噬菌體DNA的製備81

方案214用作克隆載體的雙限制性酶切割的λ噬菌體DNA的製備83

方案215λ噬菌體載體DNA的鹼性磷酸酶處理85

方案216λ噬菌體臂的純化:通過蔗糖密度梯度離心88

方案217用於基因組文庫中的真核DNA的部分酶切：預反應91

方案218用於基因組文庫的真核DNA的部分酶切: 製備反應92

方案219λ噬菌體臂與外源DNA片段的連線94

方案220基因組文庫的擴增96

方案221噬菌體DNA從噬菌斑轉移到濾膜98

方案222噬菌體DNA在濾膜上的雜交101

方案223λ噬菌體快速分析：從平板裂解物中純化λDNA103

方案224λ噬菌體分離物的快速分析：從液體培養物中純化λDNA106

第3章M13噬菌體載體

方案31M13噬菌體鋪平板109

方案32M13噬菌體液體培養111

方案33M13噬菌體雙鏈（複製型）DNA的製備112

方案34M13噬菌體單鏈DNA的製備114

方案35單鏈和雙鏈M13噬菌體DNA的大規模製備116

方案36M13噬菌體作為克隆載體118

方案37重組M13噬菌體克隆的分析121

方案38用噬菌粒載體製備單鏈DNA122

第4章高容量載體的套用

方案41用黏粒載體構建基因組DNA文庫126

方案42通過雜交方法篩選未經擴增的黏粒文庫：在雜交膜上塗鋪文庫130

方案43黏粒文庫的擴增和保存：在液體培養基中擴增132

方案44黏粒文庫的擴增和保存：在膜上擴增133

方案45噬菌體P1及其克隆系統的套用135

方案46在Ecoli宿主間轉移P1克隆138

方案47細菌人工染色體基本操作139

方案48從小規模培養物中分離BAC DNA141

方案49從大規模培養物中分離BAC DNA142

方案410酵母人工染色體的套用145

方案411釀酒酵母的培養和DNA製備146

方案412酵母DNA的小規模製備148

方案413用PCR方法鑑定酵母克隆150

方案414克隆在高容量載體上的基因組DNA片段末端的分離：小載體PCR152

第5章DNA凝膠電泳和脈衝場瓊脂糖凝膠電泳

方案51瓊脂糖凝膠電泳155

方案52瓊脂糖凝膠中DNA的檢測158

方案53瓊脂糖凝膠中DNA的回收：DEAE纖維素膜電泳159

方案54瓊脂糖和聚丙烯醯胺凝膠中DNA的回收：電洗脫至透析袋162

方案55陰離子交換色譜純化從瓊脂糖和聚丙烯醯胺凝膠回收的DNA164

方案56低熔點瓊脂糖凝膠中DNA的回收：有機溶劑抽提166

方案57低熔點瓊脂糖凝膠中DNA的回收：用瓊脂糖酶消化167

方案58鹼性瓊脂糖凝膠電泳169

方案59中性聚丙烯醯胺凝膠電泳171

方案510聚丙烯醯胺凝膠中DNA的染色檢測174

方案511聚丙烯醯胺凝膠中DNA的放射自顯影檢測175

方案512聚丙烯醯胺凝膠中DNA片段的回收：壓碎與浸泡法177

方案513脈衝場凝膠電泳的DNA製備：哺乳動物細胞和組織DNA的分離179

方案514脈衝場凝膠電泳的DNA製備：酵母DNA的分離181

方案515限制性內切酶消化瓊脂糖凝膠栓中的DNA183

方案516脈衝場凝膠電泳的分子量標準185

方案517橫向交變脈衝場凝膠電泳（TAFE）186

方案518箝位勻強脈衝場凝膠電泳189

方案519脈衝場凝膠中DNA片段的直接回收191

方案520回收脈衝場凝膠中的DNA片段並濃縮193

第6章真核基因組DNA的製備和分析

方案61用蛋白酶K和苯酚從哺乳動物細胞中分離高分子量DNA196

方案62用甲醯胺從哺乳動物細胞中分離高分子量DNA201

方案63用纏繞法從哺乳動物細胞中分離DNA203

方案64從96孔微量滴定板上生長的哺乳動物細胞中分離DNA205

方案65從鼠尾或其它小樣本中製備基因組DNA207

方案66哺乳動物DNA的快速分離209

方案67酵母DNA的快速分離211

方案68Southern印跡：用毛細管轉移DNA到膜上212

方案69Southern印跡：DNA從一塊瓊脂糖凝膠同時向兩張膜轉移217

方案610放射性標記的探針與固定在膜上的核酸的Southern雜交219

第7章真核細胞mRNA的提取、純化和分析

方案71用酸性苯酚硫氰酸胍氯仿從細胞和組織中抽提純化RNA224

方案72一步法從細胞和組織中同時製備DNA、RNA和蛋白質226

方案73oligo(dT)纖維素層析法分離poly(A)+RNA229

方案74批量層析法分離poly(A)+RNA231

方案75根據大小分離RNA：瓊脂糖凝膠電泳分離乙醛酸化的RNA233

方案76按大小分離RNA：含甲醛的瓊脂糖凝膠電泳分離RNA235

方案77變性的RNA轉移、固定至膜237

方案78Northern雜交241

方案79純化的RNA的斑點雜交和狹縫雜交243

方案710用核酸酶S1對RNA作圖245

方案711核糖核酸酶保護：用核糖核酸酶和放射性標記的RNA探針

對RNA作圖251

方案712引物延伸法分析RNA255

第8章聚合酶鏈反應體外擴增DNA

方案81聚合酶鏈反應260

方案82製備克隆用PCR產物的純化262

方案83通過超濾去除DNA擴增產物中的寡核苷酸及過剩dNTP264

方案84PCR產物的平末端克隆265

方案85克隆PCR產物至T載體267

方案86通過PCR在擴增的DNA產物末端引入限制性內切酶位點269

方案87套用PCR的遺傳工程271

方案88套用mRNA反轉錄擴增cDNA（RTPCR）274

方案89cDNA 5′末端的快速擴增(5′RACE)277

方案810cDNA 3′末端的快速擴增（3′RACE）281

方案811套用混合寡核苷酸引物引導的cDNA擴增（MOPAC）284

方案812原核載體中DNA克隆片段的快速鑑定287

方案813長距離PCR289

方案814反向PCR291

方案815定量PCR294

方案816差異顯示PCR297

第9章放射性標記DNA探針與RNA探針的製備

方案91隨機引物法：利用隨機寡核苷酸延伸法對純化DNA片段進行放射性標記303

方案92隨機引物法：在熔化瓊脂糖存在下利用隨機寡核苷酸延伸法進行

DNA的放射性標記305

方案93利用聚合酶鏈反應製備放射性標記DNA探針307

方案94從M13噬菌體模板合成固定長度的單鏈DNA探針309

方案95從M13噬菌體模板合成非固定長度的單鏈DNA探針312

方案96體外轉錄合成單鏈RNA探針315

方案97用隨機寡核苷酸引物從mRNA合成cDNA探針318

方案98用寡聚（dT）作引物合成放射性標記的扣除cDNA探針320

方案99用隨機寡核苷酸延伸法進行扣除cDNA探針的放射性標記324

方案910利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段標記雙鏈DNA的3′端327

方案911利用T4噬菌體DNA聚合酶標記雙鏈DNA的3′端329

方案912用[α32P]3′脫氧腺苷5′三磷酸或[α32P]雙脫氧ATP進行雙鏈

DNA 3′突出端的末端標記331

方案913用鹼性磷酸酶進行DNA片段的去磷酸化332

方案914含5′突出羥基端的DNA分子的磷酸化334

方案915去磷酸化的5′平端或5′凹端DNA分子的磷酸化336

方案916通過交換反應進行5′突出端DNA分子的磷酸化338

第10章人工合成的寡核苷酸探針

方案101用聚丙烯醯胺凝膠電泳純化合成的寡核苷酸341

方案102寡核苷酸5′末端磷酸化345

方案103乙醇沉澱法純化放射性標記的寡核苷酸347

方案104CPB沉澱法純化放射性標記的寡核苷酸348

方案105大小排阻層析法純化放射性標記的寡核苷酸349

方案106用SepPak C18柱層析法純化放射性標記的寡核苷酸351

方案107用大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段標記合成的寡核苷酸352

方案108寡核苷酸探針液相雜交：用含季銨鹽緩衝液洗滌355

方案109解鏈溫度的實驗測定357

第11章cDNA文庫製備及基因鑑定

方案111cDNA文庫的構建361

階段1反轉錄酶催化合成cDNA第一鏈361

階段2cDNA第二鏈的合成363

階段3cDNA的甲基化366

階段4與接頭或銜接子的連線368

階段5Sepharose CL4B凝膠過濾分離cDNA371

階段6cDNA與λ噬菌體臂的連線373

方案112真核表達文庫的構建與篩選374

階段1在真核表達載體上構建和篩選cDNA文庫374

階段2在真核表達載體上構建的cDNA文庫的篩選376

方案113外顯子捕獲與擴增379

階段1文庫的構建379

階段2電穿孔法將文庫DNA轉染COS7細胞382

階段3mRNA的提取383

階段4反轉錄PCR385

階段5克隆分析389

方案114用大片段基因組DNA克隆直接篩選cDNA391

第12章DNA測序

方案121建立隨機重疊DNA插入文庫397

方案122用於雙脫氧鏈終止法測序的變性雙鏈DNA模板製備402

方案123用T7噬菌體DNA聚合酶（測序酶）進行雙脫氧測序反應404

方案124用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段及單鏈DNA模板進行雙脫

氧測序反應408

方案125用Taq DNA聚合酶進行雙脫氧測序反應411

方案126循環測序：用PCR和末端標記的引物進行雙脫氧測序反應414

方案127化學測序法417

方案128變性聚丙烯醯胺凝膠的製備420

方案129含甲醯胺的變性聚丙烯醯胺凝膠的製備423

方案1210配製電解質梯度凝膠424

方案1211DNA測序凝膠的加樣和電泳425

方案1212放射自顯影與測序凝膠的解析428

第13章誘變

方案131含尿嘧啶的單鏈噬菌體M13 DNA製備431

方案132寡核苷酸指導的單鏈DNA誘變434

方案133以雙鏈DNA為模板的體外誘變：用DpnⅠ選擇突變體437

方案134通過單一限制位點消除進行寡核苷酸指導的誘變（USE誘變）440

方案135利用大引物PCR在同一試管中進行高效快速定點誘變444

方案136重疊延伸法產生特專一位點誘變446

方案137用放射性標記的寡核苷酸雜交篩選定點誘變重組克隆449

方案138利用單鏈構象多態性分析方法檢測突變454

方案139利用外切核酸酶Ⅲ消化產生多組嵌套缺失突變體458

方案1310利用BAL31核酸酶消化法產生套缺失突變體460

第14章表達文庫的篩選

方案141篩選構建於λ噬菌體載體的表達文庫465

方案142篩選構建於質粒載體的表達文庫470

方案143抗血清中交叉反應抗體的去除：假篩選476

方案144抗血清中交叉反應抗體的去除：與Ecoli裂解液孵育477

方案145抗血清中交叉反應抗體的去除：親和層析479

方案146λ噬菌體表達文庫中DNA結合蛋白的鑑定480

方案147λ溶原噬菌體編碼的融合蛋白裂解液的製備：細菌菌落的裂解484

方案148λ溶原噬菌體編碼的融合蛋白裂解液的製備：瓊脂平板的裂解性感染487

方案149λ溶原噬菌體編碼的融合蛋白裂解液的製備：液體培養基中的

裂解性感染489

第15章克隆基因在大腸桿菌中的表達

方案151利用IPTG可誘導啟動子在大腸桿菌中表達克隆基因491

方案152利用T7噬菌體啟動子在大腸桿菌中表達克隆基因493

方案153利用噬菌體λpL啟動子在大腸桿菌中表達克隆基因496

方案154利用鹼性磷酸酶啟動子（phoA）和信號肽序列分泌表達外源蛋白499

方案155利用谷胱甘肽瓊脂糖親和層析純化融合蛋白502

方案156利用直鏈澱粉樹脂親和層析純化麥芽糖結合蛋白融合蛋白504

方案157利用固化Ni2+吸收色譜純化帶His標籤的蛋白507

方案158從包含體中純化表達蛋白509

第16章克隆基因轉入培養的哺乳動物細胞

方案161脂質體介導的DNA轉染514

方案162磷酸鈣介導的質粒DNA轉染真核細胞517

方案163磷酸鈣介導的高分子量基因組DNA轉染真核細胞520

方案164DEAE葡聚糖介導的高效轉染522

方案165利用電穿孔技術介導DNA轉染細胞524

方案166利用基因槍技術介導DNA轉染細胞527

方案167利用Polybrene介導DNA轉染細胞529

第17章哺乳動物細胞基因表達分析

方案171DNA酶Ⅰ足跡法確定蛋白質在DNA序列上的結合位點532

方案172凝膠阻滯實驗確定DNA結合蛋白537

方案173DNA酶Ⅰ超敏感位點作圖539

方案174行進間轉錄分析541

方案175哺乳動物細胞抽提物中氯黴素乙醯轉移酶的活性分析547

方案176哺乳動物細胞抽提物中螢光素酶的活性分析549

方案177哺乳動物細胞抽提物中β半乳糖苷酶的活性分析551

方案178四環素作為調節物誘導目的基因在哺乳動物細胞中的表達553

階段1pTettTAk穩定轉染成纖維細胞553

階段2四環素調控的目的基因轉染可誘導表達tTA基因的NIH3T3細胞556

階段3分析轉染細胞中表達的蛋白質559

方案179蛻皮激素作為調節物誘導目的基因在哺乳動物細胞中的表達561

第18章蛋白質相互作用研究技術

方案181雙雜交和其它雙成分系統563

階段1誘餌LexA融合蛋白的鑑定563

階段2篩選一個相互作用子567

階段3陽性相互作用的再次確定571

方案182用GST融合蛋白進行Far Western印跡來檢測蛋白蛋白相互作用576

方案183用GST融合蛋白沉降技術檢測蛋白蛋白相互作用579

方案184通過免疫共沉澱鑑定結合蛋白581

方案185採用GFP和螢光共振能量轉移技術測定蛋白質相互作用584

階段1用螢光染料標記蛋白質584

階段2進行FLIMFRET分析前的準備587

階段3FLIMFRET測量589

方案186利用BIAcore通過表面等離子共振光譜學技術分析蛋白質的相互作用591

階段1捕獲表面的製備和結合活性測試591

階段2抗原抗體相互作用的動力學分析594