分子克隆技術是70年代才發展起來的，它的出現和套用開闢了分子遺傳學研究的新領域，打開了人類了解、識別、分離和改造基因，創造新物種的大門。它的成就對於工業、農牧業和醫學產生深遠影響，並將為解決世界面臨的能源、食品和環保三大危機開拓一條新的出路。
基本介紹
- 中文名：分子克隆化
- 起源：70年代
- 性質：科學
- 類別：醫學
重要意義,方法,
重要意義
在醫學方面，利用分子克隆技術已將胰島素，人、牛和雞的生長激素、人的干擾素、鬆弛素、促紅細胞生長激素、B型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因製成工程菌，利用發酵工業進行了大規模生產。還可提高微生物本身所產生的蛋白酶類和抗生素類藥物的產量。
在基因治療方面。通過遺傳工程看到癌細胞具有逆轉為正常細胞的可能性，例如SV40病毒引起的小鼠腫瘤細胞，在溫度高時可逆轉為正常細胞。為治療半乳糖血症，用帶有大腸桿菌乳糖操縱子的λ噬菌體去感染半乳糖血症患者的離體培養細胞，發現這種細胞的半乳糖苷酶達到了正常水平，並確實能代謝半乳糖。
在工業生產方面，以分子克隆技術為主體的基因工程、細胞工程、酶工程和發酵工程，四者緊密聯繫、常綜合利用。許多化學試劑如丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、環氧乙烷、烏頭酸和水楊酸等都可能利用分子克隆技術得到產品。在環境保護方面，人們根據需要進行基因操作，將某種微生物的基因轉入另一微生物，創造一些對有害物質降解能力更強的新菌種，以分解工業污水中的有毒物質。在食品工業方面，細菌可為人類生產有價值的蛋白質、胺基酸和糖等。
在農業生產方面，植物遺傳工程對提高農作物的產量、培育新的農作物品種提供了可能。有許多外源基因導入植物獲得成功。
方法
(1)DNA片段的製備：常用以下方法獲得DNA片段：①用限制性核酸內切酶將高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超音波)取得DNA隨機片段；③在已知蛋白質的胺基酸順序情況下，用人工方法合成對應的基因片段；④從mRNA反轉錄產生cDNA。
(2)載體DNA的選擇：
①質粒：質粒是細菌染色體外遺傳因子，DNA呈環狀，大小為1-200千鹼基對(kb)。在細胞中以游離超螺旋狀存在，很容易製備。質粒DNA可通過轉化引入寄主菌。在細胞中有兩種狀態，一是“緊密型”；二是“鬆弛型”。此外還應具有分子量小，易轉化，有一至多個選擇標記的特點。質粒型載體一般只能攜帶10kb以下的DNA片段，適用於構建原核生物基因文庫，cDNA庫和次級克隆。
②噬菌體DNA：常用的λ噬菌體的DNA是雙鏈，長約49kb，約含50個基因，其中50%的基因對噬菌體的生長和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌體DNA兩端。中間是非必需區，進行改造後組建一系列具有不同特點的載體分子。λ載體系統最適用於構建真核生物基因文庫和cDNA庫。
M13噬菌體是一種獨特的載體系統，它只能侵襲具有F基因的大腸桿菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌內是雙鏈環狀分子，象質粒一樣自主制復，製備方法同質粒。寄主菌可分泌含單鏈DNA的M13噬菌體，又能方便地製備單鏈DNA，用於DNA順序分析、定點突變和核酸雜交。
③拷斯(Cos)質粒：是一類帶有噬菌體DNA粘性末端順序的質粒DNA分子。是噬菌體－質粒混合物。此類載體分子容量大，可攜帶45kb的外源DNA片段。也能象一般質粒一樣攜帶小片段DNA，直接轉化寄主菌。這類載體常被用來構建高等生物基因文庫。
(3)DNA片段與載體連線：DNA分子與載體分子連線是克隆過程中的重要環節之一，方法有：①粘性末端連線，DNA片段兩端的互補鹼基順序稱之為粘性末端，用同一種限制性內切酶消化DNA可產生相同的粘性末端。在連線酶的作用下可恢復原樣，有些限制性內切酶雖然識別不同順序，卻能產生相同末端。②平頭末端連線，用物理方法製備的DNA往往是平頭末端，有些酶也可產生平頭末端。平頭DNA片段可在某些DNA連線酶作用下連線起來，但連線效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端連線。④人工接頭分子連線，在平頭DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性內切酶識別位點的寡核苷酸片段，經限制性內切酶作用後就會產生粘性末端。
連線反應需注意載體DNA與DNA片段的比率。以λ或Cos質粒為載體時，形成線性多連體DNA分子，載體與DNA片段的比率高些為佳。以質粒為載體時，形成環狀分子，比率常為1∶1。
(4)引入寄主細胞：常用兩種方法：①轉化或轉染，方法是將重組質粒DNA或噬菌體DNA(M13)與氯化鈣處理過的宿主細胞混合置於冰上，待DNA被吸收後鋪在平板培養基上，再根據實驗設計使用選擇性培養基篩選重組子，通常重組分子的轉化效率比非重組DNA低，原因是連線效率不高，有許多DNA分子無轉化能力，而且重組後的DNA分子比原載體DNA分子大，轉化困難。②轉導，病毒類侵染宿主菌的過程稱為轉導，一般轉導的效率比轉化高。
(5)克隆的選擇：
①直接篩選：有些載體帶有可辨認的遺傳標記，能有效地將重組分子與本底區分。例如：有些λ噬菌體攜帶外源基因後形成的噬菌斑就會從原來的混濁變為清亮；還有些載體分子攜帶外源基因後，形成的菌落或噬菌斑的顏色有明顯變化，如藍色變為無色；有些λ噬菌體能侵染甲菌而不能侵染乙菌，攜帶外源DNA片段後便能侵染乙菌，因此乙菌釋放的噬菌體均為重組分子。
②間接篩選：有引起載體分子帶有一個或多個抗藥性標記基因，當外源DNA插入到抗藥基因區後，基因失活，抗性消失。如一質粒有A和B兩個抗藥性基因，當外源基因插入到B基因區後，便只抗A藥而不抗B藥。因此能在A藥培養基上正常生長而不能在B藥培養上生長的便是重組分子。
③核酸雜交：廣泛用於篩選含有特異DNA順序的克隆。方法是將菌落或噬菌斑“印跡”到硝酸纖維膜等支持物上，變性後固定在原位，然後與標記的核酸探針進行雜交。陽性點的位置就是所需要的克隆。
④免疫學方法：如果重組克隆能在宿主菌中表達，就可以用特異的蛋白質抗體為探針，進行原位雜交，選擇特異的克隆。
