為了克服傳統巴氏塗片技術的缺陷及其他新技術成本高昂的弊端，一種依據傳統巴氏塗片的技術原理進行改良的技術方法，命名為“冷凍式巴氏塗片檢測方法”。
基本介紹
- 中文名：冷凍式巴氏塗片檢測方法
- 材料：分別採用傳統巴氏塗片
- 歷史背景：技術傳統套用已有達50餘年
- 特點：操作簡便，無需特殊設備
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歷史背景
傳統巴氏塗片技術的套用已有達50餘年，為世界範圍內宮頸癌的防治作出了極其重要的貢獻。它採用的方法是套用棉簽及刮板等採樣器在宮頸處採集細胞樣本，直接塗抹於玻片上並固定30 min後直接進行染色，其特點：簡便快捷，成本低廉，但該技術被認為具有一個天生的缺陷，即細胞收集不全，塗片細胞重疊，著色不良。由於存在上述缺陷，醫學專家相繼發明了多種細胞學改良技術如TCT、LCT等技術，對於避免傳統巴氏塗片的缺陷具有一定的作用，但這些技術操作複雜，需要具備特殊設備及專用耗材，成本高昂，難於普遍推廣，實際套用中具有很大的局限，特別是在需要進行大批量細胞塗片檢測時，上述技術缺陷表現得更為突出。
材料與方法
標本
分別採用傳統巴氏塗片及冷凍式巴氏塗片的製片方法進行塗片製作。
方法
2.1 操作步驟
標本採集時套用宮頸細胞專用採樣器（國家實用新型專利號：ZL200420043365.4）在宮頸移行區進行規範性採樣；取樣完成後迅速將採樣器上的細胞均勻塗抹在清潔的玻片上的一端2/3面積上；帶有細胞的玻片迅速置於細胞固定液中固定30 min；固定後細胞玻片送到細胞病理室即刻或稍緩後置於細胞形態修復液中1 min～5 min；經形態修復液處理後的玻片放入冰櫃冷凍層內30 min以上或更長時間（不限時長）；冷凍後取出玻片在常溫下直接進行HE染色染色、鏡下觀察並按TBS診斷標準進行診斷。
2.2 HE染色方法
冷凍後細胞玻片水洗1 min；蘇木精液染色3 min；流水洗去蘇木精液1 s～3 s；1%鹽酸乙醇分化1 s～3 s；水洗10 s～30 s；促藍液返藍10 s～30 s；流水沖洗10 min～15 min；水洗1 s～2 s；95%乙醇1 min～2 min；沉澱酸化伊紅Y乙醇工作液染色1 s～5 s；水洗1 s～2 s；80%乙醇洗1 s～2 s；95%乙醇3 s～5 s；無水乙醇5 min～10 min；石炭酸二甲苯5 min；二甲苯（I）2 min；二甲苯（II）2 min；二甲苯（III）2 min；中性樹膠封固，涼乾後送細胞診斷室。
2.3 主要染色液的配製
蘇木精染液配製:配好蘇木精染液是HE染色的關鍵，蘇木精配製有多種配方，關鍵在於氧化，如加氧化汞作氧化劑時，要防止氧化過度，同時注意形成的氧化膜污染切片。加碘酸鈉作氧化劑時，就無需把蘇木精液煮沸。要配製自然成熟的蘇木精則不需加氧化劑，但要較長時間才能氧化成熟。不同蘇木精染液的染色時間為3 min～20 min，自然氧化成熟的蘇木精液染色時間可以更長。我們使用Harri's蘇木精配製方法即取蘇木精1g，無水乙醇10 ml，硫酸鋁鉀20 g，蒸餾水200 ml，氧化汞0.5 g，冰醋酸8 ml，分別用無水乙醇溶解蘇木精，蒸餾水加熱溶解硫酸鋁鉀，然後兩液混合併煮沸，加入氧化汞，繼續加熱和攪拌至溶液為深紫色，立即用冰水冷卻，恢復至室溫後過濾備用。
沉澱酸化伊紅Y乙醇工作液配製:對於巴氏塗片的伊紅染色至關重要，選取配製不同的伊紅工作液將影響細胞漿的染色。實踐中我們認為採用沉澱酸化法配製的伊紅Y乙醇工作液，其染色效果極佳，具體如下：取伊紅20 g，蒸餾水500 ml,將伊紅與蒸餾水充分溶解後加濃鹽酸10 ml，用玻璃棒不斷攪拌，放置過夜析出沉澱。用一張大號濾紙過濾。濾液不要，加蒸餾水洗滌留在濾紙上的沉澱。蒸餾水過濾後，再加蒸餾水洗，如此反覆多次洗滌後，將沉澱物連同濾紙一起放置在恆溫箱中乾燥，用95%乙醇1 000 ml配成飽和液，此即沉澱酸化伊紅Y乙醇飽和儲存液。使用時取飽和液1份，加95%乙醇1份。玻片在進入該伊紅液前，須先入95%乙醇1 min～2 min。
結果
鏡下所見：細胞形態結構清晰，無皺縮自溶現象，細胞著色良好，顏色清晰艷麗，與藍色的細胞核對比突出，胞漿、核染色質、核仁和其他細胞各成分清晰，細胞境界清楚，細胞分辨度、透明度、對比度良好。與傳統巴氏塗片比較，該方法顯著地改善了傳統巴氏塗片細胞染色欠佳，著色不良，細胞境界難於辨識的弊病。通過上述處理後的塗片即使細胞區域塗具有一定的重疊及炎症細胞過量時，細胞的輪角仍然清晰可現。對於有病變的細胞及相關成分（癌細胞、癌前病變、真菌、挖空細胞等）易於識別，明顯提高了診斷率，降低漏診率。通過前述的規範性細胞取樣及塗片，鏡下細胞量充足，重疊明顯減少，擠壓變形的無效細胞量較少。
討論
以George Papanicolaou博士命名的巴氏細胞塗片方法進行宮頸癌的篩查已有近50 a，對宮頸癌及癌前病變的發現及治療產生了深刻的影響。由於該項技術操作簡便，無需特殊設備，從而得以在許多國家推廣並成功地降低了子宮頸癌的發病率和死亡率，但在長期的套用過程中發現，巴氏塗片存在數量不小的漏診誤診率，因此，有人認為傳統的巴氏細胞塗片本身是一項篩查子宮頸癌重要而不完美的篩查方法,相關文獻報告中發現傳統巴氏塗片對宮頸的高度病變和癌有較高的特異度，但靈敏度偏低。高特異度意味著細胞學能夠正確識別那些確實患有高度病變或子宮頸癌的婦女，特異度較低意味著細胞學僅能識別相對少部分患高度病變或癌的婦女，在保持高特異度的情況下很難增加靈敏度。據最近的一些分析報導，巴氏細胞學塗片的靈敏度相當低，在50%左右，有些甚至僅為20%[5,6]。在辛巴威的一項研究中，巴氏細胞學塗片識別高度病變的靈敏度為44%，特異度為91%，這些研究者指出當衛生決策者制定衛生政策時，應將巴氏塗片檢查低靈敏度予以考慮。
