《兩類植物抗菌肽氧化重摺疊機制及影響因素的比較研究》是依託電子科技大學,由馮娟擔任醒目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：兩類植物抗菌肽氧化重摺疊機制及影響因素的比較研究
- 依託單位：電子科技大學
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：馮娟
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
富含半胱氨酸蛋白的氧化重摺疊研究是解決蛋白質摺疊這個生命科學熱點問題的必經之路。本項目選擇了兩類含有8個半胱氨酸的硫素類抗菌肽alpha1-purothionin和Gcthionin進行比較，前者來源於小麥，屬於模式蛋白，後者是從本實驗室構建的手掌參cDNA文庫中篩選獲得的一類新型植物防禦素。在前期原核表達、Western blot鑑定、純化獲得目標蛋白的基礎上，本項目擬通過酸處理、反相HPLC、質譜、核磁、圓二色、螢光、拉曼等手段研究這兩類抗菌肽的氧化重摺疊機制，揭示天然結構、非天然結構的中間體在摺疊過程中的作用。並在Blast序列比對、蛋白二級結構預測等軟體分析的基礎上，對蛋白特定區域的胺基酸殘基進行理性突變，研究不同蛋白突變體的摺疊途徑、摺疊動力學、產物結構及功能是否存在差異。相關研究旨在豐富蛋白質摺疊理論，同時為尋找不同硫素類抗菌肽之間的關聯及實現它們的相互轉化提供有意義的指導。
結題摘要
富含半胱氨酸蛋白的氧化重摺疊研究是解決蛋白質摺疊這個生命科學熱點和難點問題的必經之路。本項目選擇了1個含有8個Cys的抗菌肽Gcthionin和1個含有12個Cys的個GcGASA進行研究, 我們圍繞這兩類蛋白的原核表達、一系列突變體構建、生物活性方面開展了大量的工作，包括：（1）對於GcGASA蛋白，在採用pET-28(a)作為原核表達載體，構建野生型重組質粒的基礎上，採用定點突變技術構建了10個CysSer突變體，並對其抗氧化、抗菌活性進行了研究，發表了兩篇SCI文章；（2）對於新型植物防禦素Gcthionin，採用pET-32(a)作為原核表達載體，進行了原核表達、親合層析，酸切割及HPLC的研究，並檢測了其抗真菌活性，發現融合蛋白及合成的多肽均等能抑制禾穀鐮刀菌孢子萌發；另外，通過定點突變技術構建了多個理想的突變體，完成了預期的部分工作，解決了氧化重摺疊最重要的樣品問題。對於具體的氧化重摺疊工作，我們從GcGASA包含體入手，採用稀釋、透析、柱上復性等方法摸索了氧化重摺疊的條件，並藉助酸處理，反相HPLC初步觀察了氧化重摺疊過程，結果發現重摺疊產物與去摺疊蛋白的疏水性質非常接近，其流出時間差異較小，目前尚在對各種重摺疊條件及影響因素進行最佳化，以期獲得更好的結果。
