內皮抑素(endostatin) 是目前作用最強、實驗效果最好的腫瘤血管生成抑制劑，近年來倍受關注，目前在美國已進行Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗，並有可能成為新一代抗腫瘤藥物。
基本介紹
- 中文名：內皮抑素
- 外文名： endostatin
- 類型：腫瘤血管生成抑制劑
- 生物學功能：對血管內皮細胞的抑制作用
結構特點,生物學功能,
結構特點
內皮抑素是1997 年O’Reilly 等[1]從培養的小鼠內皮細胞瘤( EOMA) 上清中分離純化的一種內源性血管生成抑制劑,為20 kd 分子量蛋白質。胺基酸序列分析顯示:內皮抑素為膠原18 分子C 末端部分,共184 個胺基酸。內皮抑素是膠原18 的降解產物,降解過程至少包括兩步酶解,參與酶解的可能有彈性蛋白酶、組織蛋白酶L 和基質金屬蛋白酶[2] 。進一步晶體結構分析發現:內皮抑素結構表面有一由11 個精氨酸殘基組成的鹼性區域,為肝素結合位點,這解釋了內皮抑素對肝素的高親和力特性,也可能是通過該區域與血管生成因子競爭結合肝素,起到抑制血管生成作用。但也有研究表明內皮抑素與血管壁的結合不依賴於肝素結合位點,且與FGF - 2 無競爭性抑制作用[3] 。此外,在內皮抑素序列中發現由其N 端第1 ,3 ,11 位3 個組氨酸及第76 位的天冬氨酸殘基組成的鋅離子結合位點,鋅與內皮抑素的N 端環繞形成一個二聚體結構。最初認為內皮抑素與鋅離子結合對其抗血管生成活性很重要,但後來通過基因修飾方法去除鋅離子結合位點的研究表明,內皮抑素抑制內皮細胞的遷移及腫瘤的生長並不依賴鋅離子結合位點[4] 。
生物學功能
2. 1 內皮抑素對血管內皮細胞的抑制作用 內皮抑素能特異性抑制血管內皮細胞在bFGF 誘導下的增殖,抑制內皮細胞的遷移,誘導內皮細胞凋亡,但對非內皮細胞,如平滑肌細胞、3T3 成纖維細胞、Lewis 肺癌細胞等均無抑制作用[5] 。Kim 等[6] 研究也證明,內皮抑素能抑制人臍靜脈內皮細胞穿透人工基底膜的能力,且與抑制效果呈劑量依賴關係。
2. 2 內皮抑素對血管生成的抑制作用 目前,多種實驗都能證實內皮抑素對生長的血管產生抑制作用,而對靜止的血管組織不起作用。O’Reilly 等[1] 通過雞胚絨毛尿囊膜(CAM) 實驗,用大腸桿菌或桿狀病毒表達的內皮抑素均顯示出對雞胚血管生成有明顯抑制作用,且未見毒性反應。Bloch 等[7]研究證明內皮抑素並不影響小鼠傷口癒合、傷口收縮、傷口感染及傷口上皮再生,但能減少肉芽組織的形成。Yin 等[8]將攜帶內皮抑素基因的重組慢病毒注入由TNF 誘導的小鼠初期類風濕性關節炎的關節內,結果顯示內皮抑素可抑制關
節內血管生成及血管翳的形成,減緩類風濕性關節炎的進展。說明內皮抑素不僅可以抑制腫瘤血管新生,對病理性血管性炎症也有抑制作用。
2. 3 內皮抑素對腫瘤生長和轉移的抑制作用 國內外許多學者利用重組內皮抑素蛋白或通過內皮抑素基因治療實驗表明,內皮抑素對多種實體瘤的生長和轉移都能產生抑制作用。Bohen 用鼠重組內皮抑素幾乎完全抑制小鼠Lewis 肺癌、黑素瘤、纖維素瘤、血管內皮瘤、腎細胞癌等原發灶腫瘤的生長,治療6 周期後腫瘤進入休眠期,停藥後腫瘤無復發,且未見轉移灶發生,不產生耐藥性。同時在細胞水平,也有實驗證明內皮抑素能抑制腫瘤細胞在人工基底膜凝膠中的遷移[6] 。Perletti 等利用二甲基苯並蒽(DMBA) 誘發的大鼠乳腺癌動物模型, 連續4 周每天皮下注射內皮抑素20mg/ kg ,使腫瘤停藥後4 周仍處於休眠狀態,表明內皮抑素對原發腫瘤也有明顯抑制作用。
3 內皮抑素的作用機制
目前,內皮抑素抗血管生成治療已經取得驚人的效果,但其作用機制尚未完全闡明,
其可能的作用機制主要有:
①通過下調β- 連環素(β- catenin) 的轉錄活性,抑制周期蛋白D1 的表達,引起內皮細胞G1 期阻滯[9] ;
②下調抗凋亡蛋白Bcl - 2 和Bcl - XL 的表達,誘導內皮細胞凋亡[5] ;
③與基質金屬蛋白酶2 前體蛋白(pro - MMP2) 結合形成穩定複合體,阻止pro - MMP2 的激活,並抑制MMP2 和MMP1 的催化活性,從而抑制內皮細胞的遷移[6] ;
④與原肌球蛋白結合,破壞微絲結構的完整性,使細胞運動功能喪失,誘導凋亡[10] ;
⑤抑制c - myc 表達而抑制內皮細胞遷移;
⑥通過肝素結合位點與內皮細胞表面的接頭蛋白Shb 受體的SH2 區域結合,激活酪氨酸激酶信號轉導系統,導致內皮細胞G1期阻滯, 誘導內皮細胞凋亡;
⑦整合素α5β1 在調節bFGF 誘導的血管生成中起重要作用,內皮抑素可以和整合素α5β1 直接結合,影響內皮細胞同細胞外基質的黏附,抑制內皮細胞的遷移和生長[11] ;
⑧抑制VEGF 受體KDR/ Flk - 1 酪氨酸磷酸化,從而抑制VEGF 與內皮細胞的結合,抑制VEGF 誘導的細胞外信號調節激酶ERK活性[12] 。
4 內皮抑素抗腫瘤血管生成治療的研究
4. 1 直接使用重組內皮抑素蛋白
目前重組內皮抑素基因工程表達系統主要有大腸桿菌表達系統、酵母表達系統、哺乳動物細胞表達系統等。大腸桿菌表達系統表達量高,但產物多以包涵體形式存在,不可溶解,難以復性,造成套用不便,雖然經過蛋白重新摺疊可溶,但此過程會損失大量蛋白。哺乳動物細胞的表達產物活性高,但是表達量低,難以純化。而用酵母表達產量高,易於純化,活性高,特別是畢赤酵母表達系統被廣泛地套用於內皮抑素的表達,目前美國用於I期臨床試驗的內皮抑素就是畢赤酵母的表達產物。O’Reilly 等[1]利用大腸桿菌表達的內皮抑素注入荷瘤小鼠體內,2. 5 mg/ kg 使Lewis 肺癌移植瘤體積縮小53 % ,10 mg/ kg 則瘤體體積縮小97 % ,增至20 mg/ kg ,原發瘤幾乎完全萎縮,而0. 3 mg/ (kg·d) 的內皮抑素就能完全抑制Lewis 肺癌轉移灶的生長。
4. 2 通過載體轉導內皮抑素基因
通過適當載體轉導內皮抑素基因,使其在體內長期、穩定表達生物活性高的內皮抑素,有效地彌補了蛋白治療的不足。已證實質粒、脂質體、腺病毒、逆轉錄病毒、腺相關病毒及慢病毒等都是有效的載體。相對非病毒載體,套用病毒載體轉染後可獲得更高的內皮抑素血漿濃度。Feld2man 等[13]將表達內皮抑素的腺病毒重組體經尾靜脈注入MC38 腺癌小鼠體內,小鼠血漿內皮抑素濃度高達1 770 ng/ ml ,使相對不易感染腺病毒的MC38 腺癌抑制率仍達40 %。
4. 3 其他治療方法
Joki 等[14] 將內皮抑素基因轉導到某些細胞內,再將這種可分泌內皮抑素的細胞用藻酸鹽包裹成微膠囊,注入大腦內後細胞可抵禦機體排斥和組織中酶的消化,持續分泌一定有效濃度的內皮抑素,並有效地抑制了神經膠質瘤的生長。同樣,通過微量泵持續給藥的方法也能使體內內皮抑素的濃度保持穩定,抑瘤效果明顯強於間斷給藥。國內學者徐根興等[15]利用青春雙歧桿菌作載體,將內皮抑素基因導入雙歧桿菌後注入腫瘤小鼠尾靜脈內,檢驗發現只在實體瘤中存在青春雙歧桿菌,而其他正常組織未見青春雙歧桿菌,同時也高效地抑制了腫瘤的生長和血管新生。而且他們還用轉人內皮抑素基因雙歧桿菌製成口服製劑,經多例晚期實體腫瘤志願者臨床試驗證明,其對肝癌、胃癌、腸癌、肺癌等實體腫瘤的治療有較好的抑瘤效果。
5 問題與展望
內皮抑素從發現到進入目前Ⅱ期臨床試驗,短短數年時間,取得的進展令世人倍受鼓舞。實驗表明內皮抑素特異性抑制血管內皮細胞作用肯定,對多種依賴血管生成的實體瘤都有抑制作用,且無耐藥性和明顯毒副作用,為腫瘤的臨床治療開闢了一條新路。隨著內皮抑素作用機制的完全闡明,及如何大規模的生產、純化高效有活性的重組內皮抑素蛋白,如何延長內皮抑素在體內的半衰期,如何選擇安全高效的合適載體來進行基因治療,如何正確地選擇適應症和治療對象等這一系列問題的解決,相信內皮抑素對腫瘤的抗血管生成治療將有更大的套用前景。
