光電關聯顯微鏡

光電關聯顯微技術（CLEM）結合螢光顯微鏡和電鏡的優勢，通過在螢光照片中疊加電鏡照片，實現在一張圖像里獲得螢光的功能物質信息和電鏡的高分辨結構信息。荷蘭的Delphi在全球首次將兩種光路整合，將關聯顯微技術推向頂峰。

基本介紹

• 中文名：光電關聯顯微鏡
• 外文名：Correlative Light and Electron Microscopy/CLEM
• 套用領域：生物圖像 生物功能和結構解析
• 特點：效率高，結果準，出圖快，簡單

螢光顯微鏡

螢光顯微鏡用單色的可見光照射樣品，玻璃物鏡放大經樣品反射或透過的光信號，相機採集記錄光信號成像。生物研究根據細胞內物質跟螢光染料結合的特異性，螢光顯微鏡通過激發染料發出螢光，從而實現對功能物質的定位，追蹤，記錄和表征。

掃描電子顯微鏡

電子顯微鏡的光源是短波長的電子束，匯聚電子束的是磁透鏡，探測器採集入射束跟樣品作用後的二次信號（背散射電子，X光子等），來獲取樣品的結構和成分信息。掃描電鏡用匯聚的電子束逐點逐行在樣品表面掃描，由於樣品形貌或成分不同，各點被激發出的二次信號的強度不同，探頭採集這些信號來成像。

顯微鏡背景

螢光顯微鏡得到的圖像是彩色的，它在大氣環境下使用，樣品可以是活的，還能通過螢光標記來獲取功能物質的吸收，轉化，分布等動態信息；但是螢光顯微鏡受到光的衍射影響，極限解析度在亞微米層級，有效放大倍數只有數千倍。電鏡用短波長的電子束作為光源，極限解析度提高到納米級別，有效放大倍數能到十萬倍或更高，電鏡還可以通過能譜，在得到結構信息時獲取樣品微區成分信息；電鏡的圖像是黑白的灰度圖，為了減少氣體分子對電子散射的影響，電鏡樣品倉需要抽一定真空，為了避免抽真空時樣品中水分揮發，電鏡樣品需要脫水或在冷凍的情況下觀察。統觀這兩種顯微鏡，彼此的缺點正是對方的優點，光電關聯顯微技術結合二者的優勢，通過在螢光照片中疊加電鏡照片，實現了在一張圖像里獲得螢光的定位信息和電鏡的高分辨結構信息。由於電鏡無法感知螢光信號，在電鏡里找到螢光所確定的感興趣區域；並讓兩種照片準確重合併給出同一信息，是關聯成功的關鍵。

顯微鏡分類

根據螢光顯微鏡和電鏡的整合程度，光電關聯顯微鏡主要分為分散式和整合式。分散式關聯技術，螢光顯微鏡和掃描電鏡是兩台獨立的機器，共用一個樣品載具，載具上有機械校準點，兩種顯微鏡通過機械校準來對同一位置點觀察，這種技術由於涉及到機械校準過程，定位和圖像重合精度不高；整合式光電關聯技術將兩種顯微鏡集成在一台機器內，兩種光路直接對同一位置點觀察，消除了重定位難問題，另外得益於整合的光路結構，兩種圖像能通過陰極螢光自動匹配，重合精度更高。光電關聯顯微作為一項新興的交叉技術，相當於給電鏡裝上了導航的眼睛，提高結構解析的效率。

顯微鏡的新進展

CLEM當前最大的進展是光路整合，即在螢光可視的情況下進行電鏡觀察，2014年荷蘭的delphi實現了全球首例光路完全整合的顯微技術, 從而徹底解決了在電鏡里定位螢光位置的問題，極大的推動了關聯顯微技術在生物研究領域的套用。樣品製備上也進展，通過控制螢光染色和電子染色的平衡，可以在一台整合的顯微鏡里同時進行螢光和電子成像，從而避免了真空改變和兩次制樣過程中引入的結構改變。