《催化人參三萜苷元生物合成的P450基因的克隆及功能鑑定》是依託吉林大學，由趙壽經擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：催化人參三萜苷元生物合成的P450基因的克隆及功能鑑定
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：趙壽經
- 依託單位：吉林大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
人參苷元是人參皂苷生物合成的最直接前體，比皂苷更具藥理活性。根據結構式的推測人參達瑪烷型三萜苷元可能是在P450催化下合成的，但缺少有關基因方面更直接的研究證據證明該種推測，且有關P450的數量、功能和P450間的關係等問題也不清楚，成為植物P450研究的薄弱環節和破解人參皂苷生物合成機理的主要障礙。本項目從解決上述問題的角度出發，以人參髮根為材料，開展以人參為代表的催化三萜苷元生物合成的P450基因的克隆與功能鑑定。採用二次差減抑制雜交研究策略篩選和克隆P450目的基因；利用RNAi與異源表達相結合的手段鑑定克隆基因的功能，探討P450間關係及多樣性和專一性機制；最後將克隆的P450有序串聯轉化具有達瑪烯二醇合成能力的工程酵母中，重建人參苷元生物合成途徑，綜合驗證苷元生物合成機制。將破解人參三萜苷元生物合成機理，填補達瑪烷三萜P450研究的空白，豐富P450在植物次生代謝方面的理論成果。
結題摘要
利用RT-PCR技術克隆了原人參二醇合成酶基因（PqD12H）。通過體外異源表達的方法對PqD12H基因的功能進行了鑑定分析，利用基因重組的方法構建重組表達載體pAUR123-D12H，轉染釀酒酵母菌。在重組釀酒酵母菌中進行PqD12H基因的表達，通過向酵母培養基中加入達瑪烯二醇作為底物，使其生成原人參二醇。進一步經RT-PCR 和HPLC 的分析後，確定PqD12H 的功能為催化達瑪烯二醇合成原人參二醇的關鍵酶基因，並且在GeneBank 上發表，登入號：JX569336。利用重組PCR方法構建了PqD12H的RNAi目標載體，通過測定RNAi的遺傳轉化髮根系中原人參二醇和原人參三醇，進一步確定PqD12H為原人參二醇合成酶基因。
