健忘性貝毒

基本介紹

• 中文名：健忘性貝毒
• 外文名：ASP
• 化學成分：多莫酸
• 所屬學科：海洋生物
• 毒性：LD50約10mg/kg

簡介

健忘性貝類毒素（AmnesicShellfish Poisoning，ASP）是由一種海洋硅藻——擬菱形藻Pseudo-nitzschiasp.產生的強神經性生物毒素，化學名稱為多莫酸（domoic acid，簡稱DA）。一種興奮性脯氨酸衍生物和神經毒素，是浮游植物代謝的產物，可以在被藻類污染的海洋食物特別是貝類中檢測到，其結構與紅藻氨酸和谷氨酸相似，是紅藻氨酸受體的興奮劑。

當某些種類的硅藻大量發生時，雙殼貝類、蝦蟹類、頭足類等較為低等的海洋動物，就能通過攝食藻類餌料而在體內積累大量的DA；它們一旦被海洋哺乳類攝食，就可能引起這些動物中毒或死亡。通過對該毒素的病理學研究發現，DA能與人類中樞神經系統（大腦海馬）的谷氨酸受體結合，引起神經系統麻痹，並能導致大腦損傷；輕者引起神志不清和記憶喪失，重者引起死亡。

在1987年發生愛德華王子島貝類中毒事件之後，加拿大政府就制定了貝肉中DA的限量標準。隨後，美國、歐洲、以及澳大利亞等紛紛採用歐盟標準，即20μgDAg-1貝肉；根據歐盟委員會指令（2002/226/EC），一旦發現貝類樣品中DA含量超標，則立刻關閉養殖場或捕撈水域。

研究一直認為雙殼貝類在積累了大量DA的情況下往往沒有任何不良症狀。但隨著研究的深入，發現赤潮毒素對雙殼貝類有多種亞致死或致死性影響；例如，產麻痹性貝毒Paralytic Shellfish Toxins（PST）的塔瑪亞歷山大藻對雙殼貝類孵化率、存活率、運動能力、濾食率和生長都有影響，同時還能抑制貝類閉殼運動、濾食率和清濾率；含有ASP的擬菱形藻P. multiserie 會引起太平洋牡蠣Crassostrea gigas 呼吸性酸中毒和缺氧現象以及血液性質的變化；與此同時，毒藻赤潮還可能是造成養殖貝類大量死亡的主要原因。

理化性質

化學結構

健忘性貝毒（ASP）的毒素成分是多莫酸（domoic acid，DA）（又譯為擬軟骨藻酸）及其一系列異構體。由於DA與紅藻氨酸（kainic acid，KA）結構上的相似性，也因為它們都是由某些海洋植物產生的胺基酸，所以二者一度被混淆。人們從紅藻門（Rhodophyta）的Chondria armata 和Digenea simplex中提取其天然產物，即KA，用來殺滅腸道寄生蟲。DA 最早是從Chondria armata中提取；Takemoto 等人於1966 年確定了其立體化學結構。Impellizzeri et al.還從另外一種紅藻Alsidium corallinum中提取出了DA。不過，直到1987年才發現DA對人體有毒，並發現產生這種毒素的是一直被認為無毒的海洋硅藻。

紅藻氨酸結構式

多莫酸的化學名稱為[2S-[2α，3β，4β（1Z，3E，3R）]]-2-羧基-4-（5-羧基-1-甲基-1，3-已二烯）-3-毗咯烷乙酸。分子式C15H21NO6，分子量311.34，結構式為DA共有10種異構體，包括Isodomoic acid A-H和C5’非對映異構體，其中Isodomoic acid D、E、F是有毒的。這些異構體可能是DA受紫外線照射後的反應產物，而不是藻類的天然產物。污染貝類和甲殼類的主要是DA，其毒性在所有異構體中是最強的（Wright and Quilliam，1995）。DA的分子式是C15H21NO6，分子量為311.33。DA 純品為白色固體粉末，溶於水，微溶於甲醇，熔點223-224℃，在紫外光譜區最大吸收波長為242nm，在體積比為1：9的乙腈/水溶液和-12℃黑暗條件下可保持穩定一年左右。DA在常溫或光照下在鹼性溶液中不會降解，但它在酸性溶液（pH=3）中一星期降解50%。DA分子中含有三個羧基和一個仲氨基，羧基結構的pKa分別為2.10、3.72、4.97，氨基結構的pKa為9.82，因此它在溶液中的存在受pH的影響。

ASP結構式

檢測方法

研究人員已經開發出了多種健忘性貝毒檢測方法，包括小鼠生物檢測、HPLLC-MS、螢光HPLC、GC-MS、TLC（薄層色譜）、胺基酸分析、CE（毛細管電泳）、CEC（Capillary electrochromatography）、ELISA、受體結合實驗（Receptorbinding assay）等，其中螢光HPLC和受體結合實驗的靈敏度（limits of detection，LOD）能達到0.001-0.002 μg ml-1，而ELISA方法的檢測下限（LOD）對貝肉樣品是3.3μgkg-1，對海水樣品是6.8 ngL-1；小鼠生物檢測由於時間較長，又不夠靈敏（只適合檢測40-100μg g-1以上濃度的DA），已經不適用於20μg g-1的DA限量標準了。歐盟的官方DA檢測方法是高效液相色譜（HPLC）法，而ELISA法及其試劑盒（ASP Direct cELISAtest kits，BiosenseLaboratories，Norway）也因具有方便、快速、靈敏等特點，於2006年被國際分析化學家協會（AOAC）核准為官方檢測方法。

高效液相色譜（HPLC）法的運用HPLC方法是AOAC（1991）推薦使用的DA檢測方法，也是歐美各國自1987年ASP事件後所採用的官方DA檢測方法。HPLC-UVD（高效液相色譜-紫外探測）法的檢測下限是10-80 ng ml-1，需要使用酸性流動相來抑制羥基離子化反應。由於DA具有一個強大的紫外色素團，所以利用簡單的無梯度HPLC和紫外探測就可以檢出；因此，ASP也是所有海洋生物毒素中最容易檢測的。

LC/MS（液相色譜/質譜聯用）法利用甲醇水溶液抽提組織勻漿，用乙腈水溶液稀釋後，再用C18固相萃取，並採用離子噴射界面。LC/MS或LC/MS/MS檢測法相當可靠，檢測下限與HPLC-UV 近似。Dahlmann et al.使用一種改進的LC-ESI-MS（電子噴射電離液質聯用法）可以一次性同時檢測包括DA在內的7種生物毒素。

毒理學

毒源

多莫酸DA最早是從Chondria armata中提取；Takemoto 等人於1966年確定了其立體化學結構。Impellizzeri et al.還從另外一種紅藻Alsidium corallinum中提取出了DA。不過，直到1987年才發現DA對人體有毒，並發現產生這種毒素的是曾經一直被認為無毒的海洋硅藻。擬菱形藻屬已有12種被報導可產生軟骨藻酸，其中澳洲擬菱形藻（P.australis）、成列擬菱形藻（P.seriata）與多列擬菱形藻（P.multiseries）的產毒性已得到廣泛的認可。而其他9種：靚紋擬菱形藻（P.calliantha）、細弱擬菱形藻（P.cuspidata）、擬柔弱擬菱形藻（P.pseudodelicatissima）、多紋擬菱形藻（P.multistriata）、尖刺擬菱形藻（P.pungens）、柔弱擬菱形藻（P.delicatesima）、P.fraudulenta、P.turgidula和P.galaxiae的毒性在不同地域則表現不同。

產毒菱形藻表面微觀結構

主要通過監測水中產毒藻的存在和數量，來對可能出現的貝毒風險提前發出警報。但是，這個屬的硅藻，特別是某些產毒種（如P. multiseries）和微毒種（如P. pungens）在普通光鏡下非常難分辨；通用的辦法是在2000倍掃描電鏡（SEM）下區分有毒藻種。因為利用掃描電鏡（SEM） 可以看到藻細胞的細微結構；在高倍率下，甚至可以看清硅藻殼上的肋紋及肋紋間擬孔的形狀、大小和數量。SEM 照片顯示了三種擬菱形藻的殼面細微結構：（1）P.pseudodelicatissima，是在近期發生的一次西北太平洋有史以來規模最大的由該藻引發的赤潮中採集的；（2）P. multiseries；（3）P. pungens。它們的主要區別在於肋紋間的擬孔：P.pseudodelicatissima 的肋紋之間只有1排方形擬孔；P. multiseries 有3-4 排孔；而P. pungens 有2-3 排孔，並且其孔徑比P. multiseries 的大。

擬菱形藻細胞微結構

擬菱形藻Pseudo-nitzschia細胞微結構圖冊參考資料。

作為產生DA的主要微藻類群（eu nitzschia sp.）廣泛分布於溫帶和寒帶水域，在春、秋季大量降雨、河流和上升流帶來豐富營養鹽時容易暴發生長形成赤潮；淡水注入和海流交匯也為擬菱形藻赤潮的形成創造了條件。Felhling et al.發現光照周期對不同種類擬菱形藻赤潮的發生有一定誘導作用。

值得注意的是，ASP的出現並非一定伴隨著擬菱形藻赤潮；有時在藻細胞濃度很低的時候，也會在貝類體內檢測到DA。不同的藻種以及同一種藻不同的藻株之間在毒素產量上是有較大差異的。從同一次赤潮水樣中取得的P. australis的DA含量可高達78pg cell-1，而P. multiserie的DA含量則只有6 pg cell-1；而在實驗室中培養的P. multiserie，的產毒量是1-20 pg cell-1。

很多海洋動物都能積累DA而不發生明顯的中毒反應，包括鳥蛤（CerASPoderma edule）、太平洋莢蟶（Siliqua patula）、太平洋巨蟹（又名黃道蟹）（Cancer magister）、泳蟹（Polybius henslowii）、鯷魚等（Vale and Sampayo，2001；Wekell et al.，2002；Costa et al.，2003），這可能是因為它們的神經生理機制與高等動物不同，或者它們對DA有較強的耐受能力。DA在動物的各種組織中積累的程度是不同的，一般在消化道積累較多；例如，DA在梭子蟹肌肉和內臟中的含量可分別達到323.1μg g-1和571.6μg g-1，是其他身體組織的4-12倍。不過，DA的積累能力在生物個體間可能差別很大。魚類對DA的吸收很差，因而毒素一般只積累在腸道中並可能在短時間內達到很高的水平（2300μg .g-1）；而肌肉的DA含量則很低。歐洲大扇貝（Pecten maximus）有可能是發現的對DA積累能力最強的貝類，它富集的DA有94%以上存在於消化道中（Blanco et al.，2002a）。Douglas et al發現，DA在海洋扇貝（Placopecten magellanicus）軟組織中蓄積量的順序是：消化腺>>其他軟組織>>閉殼肌；在投餵人工培養的P. multiseries（DA含量4.0-6.7 pg cell）6 天后，消化腺中DA的含量可高達3108μg g ，而閉殼肌中DA的含量只有0.7-1.5μg g-1。

人類通過食用海產品攝入健忘性貝毒，多通過食用貽貝、蛤類在體內積累。與貝類相比，人類通過食用魚類而受到的影響較小。據研究，當人體內貝毒含量在0．.2～0.3 mg/kg（濕重）時，機體不受影響；當達到0.9～2.0 mg/kg（濕重）時，機體會出現輕度眩暈等症狀；當達到1.9～4.0 mg/kg（濕重） 時，機體會出現方位障礙等症狀。另外，ASP具有熱穩定性，一般的烹飪過程並不能夠破壞軟骨藻酸的毒性。雖然一般家庭的蒸和煮的過程會減少貝類組織中的ASP含量，但是ASP仍會隨烹飪過程進入到烹飪油中，進而通過消化道進入人體。

健忘性貝毒作為一類神經毒素、遞質和阻斷劑在貝類組織中積累，進而間接地影響著人類的健康。對由DA引起的健忘性貝中毒還沒較好的療法，僅在小鼠實驗中發現用苯二氮草（Diazepan，5mg /kg）可減少震顫行為，但無法完全恢復受損的海馬結構或空間記憶能力。同時，研究表明軟骨藻酸對昆蟲有殺滅能力，其對嶂螂、蒼蠅的殺死效果不遜於r-BHC。主要靠預防，在毒素容易暴發的季節里（如每年的4、5月份和9、10月份），不吃或少吃貝類產品，來減輕或避免貝類毒素中毒事件的發生。

中毒機制

健忘性貝毒的毒作用機制與興奮性胺基酸受體和突觸傳導有關。興奮性胺基酸L-谷氨酸和L-精氨酸作為神經遞質與其受體結合，有開啟膜上Na+通道的作用，導致Na+內流及膜的去極化。軟骨藻酸屬於一種興奮性胺基酸類似物，與L-谷氨酸和L-精氨酸競爭地與興奮性胺基酸受體結合，且其親合力更強，使Na+通道開放，導致Na+內流及膜的去極化。另外被軟骨藻酸激活的受體打開的通道可對Ca2+高度通透，導致致死性細胞Ca2+內流。

ASP是比PSP毒素弱一些的神經性毒素，中毒者症狀奇特，多數在食後3-6h發病，主要表現為腹痛、腹瀉、嘔吐、流涎，同時出現記憶喪失、意識混亂、平衡失調、不能辨認家人及親朋好友等嚴重精神症狀，嚴重者處於昏迷狀態，重症者多為老人，並伴有腎臟損害，曾有12人病後記憶喪失長達18個月之久的報導。軟骨藻酸的LD50約10mg/kg體重（小鼠）。從中毒死亡者的病理解剖可見腦的海馬回、丘腦和杏仁核都有損傷，這與用軟骨藻酸進行動物試驗的病理結果相同。

中毒事件

歷史上唯一一次有完整記錄的健忘性貝毒中毒事件是1987年發生在加拿大愛德華王子島（Prince Edward Island）的食用貽貝中毒事件。受害者表現出（頭痛和短期記憶缺失），共有150人有中毒反應，其中107人確診為DA中毒，9人入院治療，4人死亡。最後確定引發這一事件的是擬菱形藻（Pseudo-nitzschia f. multiseries）赤潮，當時貽貝肉中DA的含量是300-1000μgg-1，而人攝入的毒素量可能達到了1-2 mg kg-1。

1991年，在美國加州的Monterey灣發現了死亡或垂死的海鳥，很多垂死海鳥都表現出了類似神經中毒的症狀，而在死鳥的胃含物中檢測到大量DA。這些海鳥主要以灣內的鯷魚（Engraulis mordax）為食，而在鯷魚的腸道中發現了擬菱形藻P. australis。1998年，在加州又發生了400多頭海獅（Zalop uscalifornianus）因攝食莎瑙魚（Sardinops sagax）和鯷魚中毒死亡的事件，這些餌料魚類也是因攝食了P.australis而含有大量的DA（Scholin et al.，2000）。這已成為威脅當地漁業的一大問題；據報當地已經發現多種有毒擬菱形藻，其中P.multiseries，P.australis，P.pungens和P.psedudodelicatissima 等種類都能產生DA，但其DA含量上有較大差異。

毒素環境監測

擬菱形藻赤潮在世界範圍內越來越頻繁地發生，而且ASP毒素對包括人類在內的多種動物都有強烈致毒作用，因而赤潮監測和減災措施就顯得非常重要。正是因為有了相對完善的赤潮監測和管理系統，作為擬菱形藻赤潮多發地區的加拿大、美國和歐洲各國，自從1987年愛德華王子島貝毒事件之後，ASP導致人類中毒的事件就再也沒有發生過。

建立完備的赤潮監測網和管理體系，是人們抵禦赤潮風險的首要措施。一方面可以通過監測水中的產毒擬菱形藻或ASP毒素來進行預測預報；另一方面也可基於對毒素經食物鏈傳遞途徑的清楚認識，開展毒素污染指示生物的定期檢測。作為赤潮指示生物的必要條件是：常見種，個體較大的非養殖生物，對毒素敏感並能快速積累而達到較高濃度；最好是積累的毒素較不容易淨化。比如加拿大和美國己經利用浪貽貝（California Surf Mussel Mytilus californianus）作指示生物。