以細菌為投遞介質誘導昆蟲RNA干涉研究

《以細菌為投遞介質誘導昆蟲RNA干涉研究》是蘇建亞為項目負責人，南京農業大學為依託單位的面上項目。

基本介紹

• 中文名：以細菌為投遞介質誘導昆蟲RNA干涉研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：蘇建亞
• 依託單位：南京農業大學

項目摘要

本項目研究棉鈴蟲通過取食表達雙鏈RNA 的細菌誘導RNA 干涉現象，以RNA.干涉技術為原理，細菌為雙鏈RNA 投遞介質，探討創製以基因為靶標的生物殺蟲劑的可能.性。研究中將克隆10-15個在棉鈴蟲幼蟲腸道細胞表達的生命活動重要基因，通過微量注射法分析這些基因片段的雙鏈RNA對棉鈴蟲幼蟲的RNA 干涉活性，觀察其表型變化，從中選出RNA 干涉活性較高、有致死表型的基因片段，再通過飼料感染法測定對棉鈴蟲幼蟲的口服RNA干涉活性，選出的基因片段用於構建表達雙鏈RNA的質粒載體，並轉化細菌，進一步測定轉化後細菌對棉鈴蟲幼蟲的殺蟲活性。為建立以RNA干涉為原理、以基因為靶標的生物殺蟲劑開創一條全新的道路，篩選出1-2 個有潛在殺蟲活性的棉鈴蟲dsRNA，並建立以基因為靶標的殺蟲劑生物測定技術，為建立創製該類生物殺蟲劑的技術平台提供技術積累與理論指導。

結題摘要

昆蟲腸道中具豐富的微生物類群，它們在昆蟲的食物消化、防禦、代謝合成等生物過程中起重要作用。本研究通過對鱗翅目幼蟲腸道菌的分析，探索利用腸道細菌通過RNA干擾效應防治害蟲的可能性。從棉鈴蟲、甜菜夜蛾、稻縱卷葉螟以及菜青蟲幼蟲腸道中共得到107個分離物，經16S RNA序列分析鑑定出腸道細菌47種，發現許多細菌種類，如微球菌、克雷伯菌、肺炎克雷伯菌為這4種昆蟲所共有，芽孢桿菌、假單胞菌與葡萄球菌在其中3種昆蟲腸道中都能分離到，這4種鱗翅目昆蟲雖然生活環境與取食寄主完全不同其幼蟲腸道菌類群卻表現出顯著的相似性，也有不少細菌種類在昆蟲腸道中的分布具有種的特異性，還首次在昆蟲腸道中發現蒂莫內馬賽菌和動性球菌。 克隆了棉鈴蟲與甜菜夜蛾幼蟲期表達的功能基因10餘個，如vATPase、VHA、coatmer、mov、EcR、USP、actin、E74、JHE、HR3、ftz-f1等，克隆得到了棉鈴蟲、甜菜夜蛾、二化螟、褐飛虱、白背飛虱與灰飛虱6種昆蟲魚尼丁受體基因的全長序列。定量PCR研究表明轉錄因子ECR與USP在幼蟲體內的表達具同步型，表達出現的峰次也相同，但ECR基因的表達時間稍早於USP的表達，而且ECR與USP在6齡後期的表達量較高，高於其它齡期的表達。轉錄因子E74、JHE、HR3、ftz-f1的表達也表現出類似的周期性規律。RNA干擾研究表明分別注射ECR或USP的雙鏈RNA或同時注射ECR與USP的雙鏈RNA到幼蟲體內使相應的基因明顯表達下調，並使幼蟲不能正常的蛻皮與化蛹，表現出顯著的發育異常表型。ECR dsRNA、USP dsRNA分別注射後，不僅其對應的ECR與USP表達量會下降，同時對其它四個轉錄因子E74、JHE、HR3、ftz-f1的表達量也有較大的影響，使這些轉錄因子的表達量同時下降，而注射ftz-f1-dsRNA卻對ECR與USP的表達量沒有明顯影響，說明轉錄因子ftz-f1位於ECR、USP基因信號轉導級聯的下游。 研究了假單胞菌和腸桿菌質粒電轉化的技術條件與方法，通過電轉化技術得到了表達EcR、vATPase等基因dsRNA的陽性轉化菌，測定了幼蟲取食陽性轉化腸道菌後幼蟲的表型變化與RNA干擾效應，建立了這些轉化菌的生物測定技術。