《介導特定DNA轉移多結構域嵌合蛋白的構建與鑑定》是依託中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院，由李霄擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：介導特定DNA轉移多結構域嵌合蛋白的構建與鑑定
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：李霄
- 依託單位：中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
裸質粒DNA曾以其安全、便捷、廉價等優越性受到廣泛關注，但質粒DNA轉導效率低下、轉染製劑毒性高、目的基因表達量不足等缺陷使其發展受限。GAL4是酵母轉錄激活因子，能特異識別並以二聚體形式結合UAS序列。GAL4的特異性DNA結合活性和核定位活性，可用於完成高效、低毒的DNA轉導，具有在基因轉導領域的研發潛質。Tat作為CPP，具有在胞外環境直接侵入胞內，甚至細胞核的功能，並已成功套用於將異源蛋白質、納米微球、脂質體、噬菌體和病毒載體等外源物質導入細胞，顯示了其在基因治療非病毒載體領域的用途。本研究擬篩選利用GAL4的DNA識別/結合基元和Tat的核定位/入胞基元，構建一種具有特異性識別、結合質粒DNA，並將特定質粒DNA導入細胞/細胞核功能的重組蛋白/多肽。為基於質粒DNA的基因治療非病毒載體提供一種高效、低毒的輔助轉導系統，拓展裸質粒DNA的套用空間。
結題摘要
本研究利用GAL4 和HIV-1 Tat構建了一種新的基因工程嵌合蛋白TG和TNG。本研究通過螢光顯微鏡評估了TG或TNG介導的細胞轉導功能，結果表明，HepG-2細胞與TG/pUAS-EGFP 和TNG/pUAS-EGFP 複合物共培養顯示強綠色螢光，而HepG-2細胞與G/pUAS-EGFP和 NG/pUAS-EGFP複合物不顯示螢光。這些結果表明含有Tat的融合蛋白TG或 TNG可介導高效的基因轉移，並有效表達外源基因。 通過MTT方法鑑定了TG 和TNG在HepG-2細胞內的抗腫瘤活性。結果顯示TG/pUAS-Apoptin 和TNG/pUAS-Apoptin 不同程度地殺傷HepG-2細胞，而TG/pUAS-Apoptin和TNG/pUAS-Apoptin之間的抗腫瘤效應沒有明顯差異。治療劑量一定時，TG/pUAS-Apoptin和TNG/pUAS-Apoptin的抗腫瘤效應具有一定的時間-效應關係。 通過AO/EB、DAPI、Caspases、△φ 和ROS方法檢測，我們分析了TG/pUAS-Apoptin和TNG/pUAS-Apoptin介導的抗腫瘤機制。結果顯示TG/pUAS-Apoptin和TNG/pUAS-Apoptin複合物可誘導HepG-2細胞凋亡。 通過小鼠模型可以觀察到TG/pUAS-Apoptin 和TNG/pUAS-Apoptin的體內抗癌活性。結果顯示TG/pUAS-Apoptin和TNG/pUAS-Apoptin治療組具有不同程度的抗腫瘤效應。而二者的抑制率沒有明顯差異。平均存活率結果顯示TG/pUAS-Apoptin和TNG/pUAS-Apoptin治療組的存活率分別為66.7% 和83.3%，均明顯高於鹽水組、pUAS 和pUAS-Apoptin治療組。另外，TG/pUAS-Apoptin和TNG/pUAS-Apoptin 對IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的濃度和NK、CTL的活性沒有影響。 總之， GAL4/147 對UAS具有特異性識別活性，Tat具有穿膜活性，本研究基於二者構建的融合蛋白TG 和TNG能夠轉染含有UAS序列的質粒，通過質粒內的Apoptin能有效抑制人肝癌細胞HepG-2生長，限制腫瘤動物模型生長。本研究為擴大裸質粒DNA的套用提供了新的空間。
