《人聚合酶Pol δ小亞基p12生化功能研究》是依託江蘇大學，由周亞竟擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：人聚合酶Pol δ小亞基p12生化功能研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：周亞竟
- 依託單位：江蘇大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
人DNA聚合酶Pol δ是真核生物染色體DNA複製過程中的一個主要複製酶，並在參與其它多種形式DNA修復過程中起著關鍵作用。目前普遍認為，人Pol δ是由四個亞基p125、p50、p68和p12構成的異源四聚體，推測小亞基p12有可能在DNA複製和損傷修復過程中調控著Pol δ的酶學功能以保證DNA複製的準確性，避免染色體突變的發生。本項目擬通過分析小亞基p12在DNA複製過程中的酶學功能，研究p12活性區域對Pol δ-DNA合成的調控，以明確p12對Pol δ-DNA複製的調控機制。同時，通過觀察各亞基在細胞亞核內DNA損傷點上的共定位，闡明細胞內p12在Pol δ-DNA損傷應對回響機制中的作用。這些研究將對我們了解人類疾病和癌症的發病機理以及發現新的診斷治療手段方面具有十分重要的意義。
結題摘要
人源DNA聚合酶δ（Pol δ）是真核生物染色體DNA複製過程中主要複製酶之一，並在參與多種形式DNA修復過程中起著關鍵作用。目前普遍認為，人源Pol δ是由p125、p50、p68和p12四個亞基構成的異源四聚體，推測p12有可能在DNA複製和損傷修復過程中調控著Pol δ的酶學功能以保證DNA複製的準確性。本基金項目研究通過建立人源Pol δ大規模製備和分離純化平台，對所獲得的Pol δ各亞基不同組合的蛋白複合物進行體外生化功能分析：在Poly(dA)/oligo(dT)為引物/模板和單鏈M13 DNA模板上的DNA活性分析顯示，缺失了p12的三亞基蛋白複合物的活性與全酶相比均有顯著下降，揭示了p12在DNA複製過程中扮演著十分重要的角色；通過比較由尿嘧啶引發DNA損傷模板上的鹼基切補修復活性，發現p12具有調控Pol δ單核苷酸切補修復與多核苷酸切補修複比例的功能；首次證實了p50也能和PCNA發生捆綁反應，並以此為依據，提出了一個新的Pol δ-PCNA蛋白複合物之間相互反應的網路模型。同時，本基金項目也對小亞基p12的多泛素化修飾途徑進行了初步探索：通過由四個不同性質層析柱組成的E3查找系統，成功地鑑定出唯一能介導p12多泛素化反應的E3連線酶 RNF8，其相應的E2/E3調控途徑為Ubc13/Uev1a/RNF8；在套用免疫親和層析柱查找由UV引發DNA損傷的細胞內與Pol δ形成複合物的相關蛋白時，也鑑定出RNF8是一個Pol δ的關聯蛋白，實驗表明RNF8是通過四個亞基與Pol δ發生捆綁反應，它與E2交聯酶UbcH5c協同介導p50亞基單泛素化反應；亞細胞共定位實驗發現，Pol δ和RNF8以共定位方式被募集到由UV射線引起的DNA損傷區域。以上研究初步明確了小亞基p12在Pol δ-DNA複製中的調控機制，闡明了p12泛素化修飾在調控Pol δ-DNA損傷應對回響機制中的作用，對從人類癌症發病的起因揭示：由於Pol δ功能改變而使得遺傳基因組不穩定，進而導致腫瘤發生的機制具有十分重要的科學意義。同時，擁有自主智慧財產權的人源Pol δ大規模製備和分離純化平台的建立，也極大地解除了制約全世界科研工作者對人源Pol δ功能進行深入研究的瓶頸，即：獲得大量、高純度、具生物活性的Pol δ四亞基蛋白複合物。
