《人工反轉型葡萄糖苷酶的分子進化及抗產物抑制研究》是依託復旦大學，由周峻崗擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：人工反轉型葡萄糖苷酶的分子進化及抗產物抑制研究
- 依託單位：復旦大學
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：周峻崗
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
產物的抑制效應是限制木質纖維素酶酶法降解的瓶頸，至今仍未取得突破性進展。β -葡萄糖苷酶是控制木質纖維素多酶降解的關鍵節點，已報導所有β -葡萄糖苷酶都是保留型酶，保留型催化是可逆的，決定了β -葡萄糖苷酶不能將底物纖維二糖、纖維三糖等寡糖完全水解，導致中間產物積累，抑制了纖維素酶解效率。反轉型糖基水解酶的催化過程是不可逆的，理論上可以實現底物的完全轉化。因此，本研究將建立不同家族非同源基因改組技術（nonhomologous DNA shuffling）,套用於GH43反轉型β-木糖苷酶和保留型GH3β-葡萄糖苷酶之間的基因改組，定向篩選反轉型β-葡萄糖苷酶，進一步研究人工反轉型β-葡萄糖苷酶的酶學特性及其抗產物抑制的分子機制，研究成果將為蛋白質體外定向進化提供新的方法，也為提高木質纖維素的糖化率提供新思路。
結題摘要
產物的抑制效應是限制木質纖維素酶酶法降解的瓶頸，至今仍未取得突破性進展。β -葡萄糖苷酶是控制木質纖維素多酶降解的關鍵節點，已報導所有β -葡萄糖苷酶都是保留型酶，保留型催化是可逆的，決定了β -葡萄糖苷酶不能將底物纖維二糖、纖維三糖等寡糖完全水解，導致中間產物積累，抑制了纖維素酶解效率。糖基水解酶(Glycosyl Hydrolase)存在有兩種不同的催化機制，一種是保留型，其酶催化的水解反應是可逆的，酶解反應容易達到平衡狀態；另一種是反轉型，其催化過程是不可逆的，催化反應一直向水解方向進行，理論上反轉型催化可以實現100%轉化率。反轉型催化是異頭位碳原子的構型轉化催化機制，即經典的一步法酸/鹼催化。水分子被酶活性中心的催化鹼激活後，在催化酸的幫助下攻擊異頭碳中心，隨後異頭碳上羥基由β構型轉變構α構型。本研究首先採用非理性的蛋白質分子進化方法，以GH43 反轉型β-木糖苷酶為母本進行基因改組和突變，另一方面我們通過母本蛋白的結晶與結構解析，發現反轉型β-木糖苷酶與底物空間距離在5 Å內的胺基酸要遠多於保留型β-葡萄糖苷酶，結合保留型與反轉型兩種催化機制的研究，我們發現反轉型酶的兩個催化胺基酸之間的距離比保留型酶的距離大，主要原因是反轉型酶的催化過程中有水分子的直接參與，需要較大的空間同時容納底物與水分子，這種機制有助於我們深入系統地分析胺基酸在蛋白結構與功能中的作用，為後續的理性改造與設計提供理論基礎。在上述基礎上，我們嘗試通過Rosetta_design的方法進行反轉型β-葡萄糖苷酶的分子構建，設計了約5000個候選蛋白，其中一些具有β-葡萄糖苷酶，但活性較低，需進一步設計與最佳化，從而提高其催化纖維寡糖的效率。
