《人乳頭瘤病毒（HPV）結構蛋白的體外可控雜合自組裝》是依託吉林大學，由吳玉清擔任項目負責人的重大研究計畫。
基本介紹
- 中文名：人乳頭瘤病毒(HPV)結構蛋白的體外可控雜合自組裝
- 項目類別：重大研究計畫
- 項目負責人：吳玉清
- 依託單位：吉林大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
人乳頭瘤病毒（HPV）是無包膜雙鏈DNA病毒，晚期表達結構蛋白L1和L2組成病毒衣殼。在適當的條件下，L1蛋白能形成五聚體（Pentamer），並由72個五聚體自組裝（Self-assembly）構成類病毒顆粒(Virus-like Particles,VLPs)。因既具簡單結構和複雜功能兩重性，又具有在適當條件下可迅速自組裝成VLPs的特點，HPV成為當前化學家和生物學家了解、認識和模擬病毒繁衍機制的有序結構及自組裝體模型。本申請首次提出不同亞型HPV L1五聚體雜合自組裝概念和研究思路，擬通過對L1蛋白結構的改變和摺疊體形狀的調控，實現由單體到五聚體、再到VLPs的多級、雜合體外可控自組裝，並揭示其中相關分子機理、組裝過程和動態機制。希望能從本質上揭示病毒蛋白結構、生物大分子自組裝體與其.功能的內在聯繫，為簡單生物體的模擬組裝開闢一條新路徑，也為有效預防或制服病毒奠定理論基礎。
結題摘要
以降低預防性人乳頭瘤病毒(HPV)疫苗成本、提高其穩定性和廣譜性為出發點，以深入HPV揭示衣殼蛋白自組裝機理和關鍵組裝因素為目的，我們重點開展的研究如下： 以高危性 HPV16 L1、18 L1為例，通過基因重組互換關鍵肽鏈段構建了兩重組L1蛋白； FPLC確認它們都能形成很好的五聚體（16和18 L1Bi-P），表明互換序列並不影響各自五聚體的形成。經體外調控組裝後，單獨的16、18L1Bi-P以及兩者混合均形成了粒徑在~50nm的VLPs。對組裝過程的穩態光散射(SLS) 監測三體系給出了完全不同的組裝機制，進一步的蔗糖梯度離心和免疫共沉澱(Co-IP)確認了兩者確實存在雜合VLPs。將雜合子經特異性抗體標記的磁珠分離後，計算出其中兩者的比例約是3:5。同時，電鏡(TEM)和動態光散射(DLS)證明雜合子是全尺寸的VLPs。假病毒中和抗體實驗結果表明純化後的雜合VLPs具有高免疫原性，並且誘導了高滴度的中和抗體。本研究為含有多種亞型雜合VLPs的研究提供了可能，也為調控生物大分子自組裝和揭示重要因素研究奠定了基礎。 在上述研究中發現，HPV16L1螺旋5 (h5) 中R466被偶然突變後不能再形成五聚體。基於此，我們分別對h5中的高度保守序列LGRKFL進行逐點突變。結果表明其中LGR分別突變成A後均無法再形成五聚體，說明h5中的LGR對五聚體形成必不可少，是潛在的抗病毒靶標；另外三點被突變成後都不影響五聚體的形成，但L469A的五聚體可溶性表達量明顯增加，大約是其野生型16WT的2倍。另外，通過研究我們發現GST融合表達的L1蛋白能正確摺疊，但由於GST的位阻效應迫使它只能以單體形式存在；經進一步酶切後的L1卻可同步組裝成五聚體。對該過程的SLS監測實現了對單體到五聚體的形成過程的原位監控，也為利用抗病毒製劑調控五聚體形成提供了新的監測途徑。 進一步，以L1中h5為靶標，設計合成了一系列能有效地抑制L1五聚體形成的小肽類抑制劑。FPLC和CD結果表明小肽序列和構象是產生抑制的關鍵。經過篩選後的pep14的IC50為27.24nM。另外，高水溶性芳烴—CP5A和SC4A對L1五聚體的形成顯示了明顯的抑制; 其中CP5A抑制效應更強，IC50 為0.62mM。但由於兩者作用靶標胺基酸的不同導致呈現了明顯不同的抑制機制。這些研究為研發大環類抗病毒藥物奠定了基礎。
