亞硝酸鹽還原酶轉錄調控蛋白NsrR去阻遏機制研究

《亞硝酸鹽還原酶轉錄調控蛋白NsrR去阻遏機制研究》是依託蘭州大學，由令楨民擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：亞硝酸鹽還原酶轉錄調控蛋白NsrR去阻遏機制研究
• 依託單位：蘭州大學
• 項目負責人：令楨民
• 項目類別：青年科學基金項目

項目摘要

亞硝酸鹽還原酶轉錄阻遏蛋白NsrR是一類廣泛存在於細菌中的Rrf2家族轉錄阻遏蛋白，其能夠廣泛調控亞硝酸鹽還原酶或一氧化氮還原酶的轉錄翻譯，NsrR對基因表達的去阻遏不僅可以通過感應亞硝酸鹽或一氧化氮而實現，硝基化合物亦能實現NsrR的去阻遏調控。因此NsrR去阻遏位點的分析及其調控模式在硝基化合物降解酶的表達中具有套用前景。本研究擬通過建立NsrR缺失表達體系，利用“目的基因敲除-目的基因體外突變體回補”的方式，結合計算機虛篩與體外實驗，驗證NsrR對其阻遏啟動子下游GFP表達的影響，進而對NsrR效應結構域位點予以鑑定和分析。具體方法擬採用：建立目的基因缺失突變體表達宿主；利用計算機虛擬篩選方式獲得NsrR效應結構域關鍵胺基酸突變體，並回補表達驗證；對NsrR的去阻遏位點予以驗證並獲得針對硝基苯污染物的NsrR突變體，實現利用NsrR精確控制降解硝基苯污染物的目的。

結題摘要

硝基苯化合物在工業中得到了廣泛套用，是一種典型污染物，長期受化工污染的環境中會存在大量的硝基污染物。其致癌性和致突變性會對人體健康及生態環境造成很大的危害。現有的處理方法主要為輻照、氧化或者電化學處理，不僅成本較高，而且易造成二次污染。所以使用微生物降解具有更高的可變性與適應性。NsrR阻遏蛋白存在於E.coli MG1655中，能夠廣泛調控亞硝酸鹽還原酶或一氧化氮還原酶的轉錄翻譯，它感應NO的脅迫而表達去阻遏基因。對其位點進行鑑定可以為之後利用此類模式生物奠定理論依據。本實驗利用大腸桿菌的Red重組系統，通過質粒pKD46及輔助質粒pCP20表達相關酶敲除NsrR基因，構建NsrR基因缺失的E.coli MG1655ΔNsrR工程菌株，建立NsrR缺失表達體系，利用“目的基因敲除-目的基因體外突變體回補”的方式，計算機虛篩結合體外實驗，驗證NsrR對其阻遏啟動子下游GFP表達的影響，進而對NsrR效應結構域位點予以鑑定和分析。結合NsrR的蛋白序列，通過i-Tasser的線上模擬分析及預測，NsrR具有典型的HTH型DNA結合蛋白結構特徵，α6螺旋結構的D8和半胱氨酸loop中的C91，C96，C102同Fe-S簇的形成和穩定有關，且D8，R12同感應NO關係較為密切。因此，我們推測NO脅迫相應蛋白通過NsrR結構中Fe-S簇的改變來感應NO或亞硝酸基團，調控DNA序列的轉錄，而其中改變D8和半胱氨酸loop中非半胱氨酸類的胺基酸將有助於NsrR效應物的改變。對NsrR相應的結構域進行改造可以實現單一調控因子進行生物強化去除環境中的含硝基污染物。利用所得到的NsrR缺陷突變株受不同含硝基污染物影響時報告基因的表達情況，可以獲得感應特徵污染物的專一突變體，從而精準檢測和降解硝基污染物。